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脊髓损伤(Spinal cord injury SCI)是骨科常见疾病,通常伴随着脊柱骨折,如果出现下脊髓的损伤常常伴随着骶尾部骨折,甚至骨盆骨折。脊髓损伤后会对患者个人、家庭以及社会造成巨大的损失。Dryden DM[1]等在2004年报道,在美国,脊髓损伤病人每年的所需要的相关费用达970万美元。为了减少脊髓损伤所造成的损失,进行大量的相关基础实验研究以及临床研究就显得非常有必要。Wyndaele[2]等2006报道从95年至06年全球每年脊髓损伤的发病率在每百万人10.4-83例;美国每年脊髓损伤的发病率大约为每百万人50例[3];Lee BB等2011报道,全球脊髓损伤的患病率为每百万人236-4187例[4,5]。2002年北京市卫生信息中心报告显示北京地区的脊髓损伤发病率为每百万人60例,与该地区80年代的每百万人6.8例的发病率相比,20余年间上升了近10倍[6]。伴随着发病率的不断上升,临床工作者需要发现更多更有效的治疗手段,以期减少脊髓损伤所造成的个人损失和社会损失。深入研究脊髓损伤的病理生理机制以及有效的治疗手段将具有非常重要的临床意义和社会价值。对于发生脊髓损伤的病人,短时间内迅速予以标准化的评分和分析至关重要,这对于后续的治疗方案拟定、治疗效果判断有极大的帮助。常见例如的有ASIA脊髓损害分级和评分、国际脊髓损伤评分标准、FIM功能独立性评定、截瘫指数法等。脊髓损伤后在急性期的治疗重点保证脊髓组织充足的供血供氧,充足的供血供氧可以减少2次继发性损伤的发生。二次继发性损伤主要发生在脊损损伤后24小时至3天之间。脊髓损伤后维持脊髓组织中细胞的微环境稳定和细胞内稳态有利于细胞正常功能的发挥。脊髓损伤常伴随血管损伤,导致脊髓组织处于缺血缺氧状态。众所周知神经细胞对于缺氧的耐受性差,因此研究缺氧状态下,脊髓损伤整个病程的病理生理机制显得尤为重要。文献报道,多种细胞作用机制和分子作用机制参与了二次继发性损伤的发生发展,例如细胞死亡、炎症过度反应、巨噬细胞/小胶质细胞激活、神经轴突退行性变、神经脱髓鞘等。文献报道缺氧状态可以调控多种细胞信号传导通路,小胶质细胞是脊髓组织中重要的免疫细胞,在缺氧状态下也可以感受到缺氧信号的刺激,从而活化,启动相关的信号转导通路,参与脊髓损伤后的病理进程。但是其具体作用机制目前研究不多,也没有统一的观点。在目前有关细胞的低氧应激的相关学术研究中,低氧诱导因子-1(hypoxic inducible factor,HIF-1)[7]是目前缺血缺氧研究最多的一个因子,也是细胞在基因转录水平协调缺氧变化的最主要的调节因子,广泛表达于哺乳动物各种组织细胞中,是组织、细胞形成缺氧耐受共同的分子生物学机制。低氧诱导因子是一种会根据细胞内氧浓度变化,及时进行相关基因表达调节的转录激活因子,其是由氧调节亚单位HIF一1ɑ以及结构亚单位HIF一1β共同组成的异二聚体。缺氧状态下HIF一1ɑ可以使自身分子开关开启,使相关基因充分表达,调控细胞适应缺氧状态,维持细胞正常功能。Autophagy这一单词来源于古希腊词汇,被称为自我吞噬,简称自噬[8]。自噬(Autophagy)是在生物进化过程中所产生的一种物质、能量再循环途径,对于细胞内细胞器的正常功能起着重要作用。一般来说,自噬的过程包括识别、封存转运、吞噬以及溶酶体的降解等过程。正常状态下脊髓中很难检测到自噬的存在,但是当发生脊髓损伤(SCI)时,脊髓中自噬现象迅速出现,脊髓损伤后会出现细胞自噬现象早已被广大学者的研究工作所证实,自噬也逐渐成为在脊髓损伤中的研究热点,神经系统损伤导致了神经细胞内大分子物质、脂类和细胞器的破坏,自噬的发生以及其对神经细胞的作用不容质疑,然而自噬激活对于脊髓损伤到底是有益还是有害目前尚有争议,没有定论。为了消除上述的相关争议,本课题组通过一系列的科研设计和实验操作,检测缺氧状态下脊髓小胶质细胞对于HIF-1α表达以及自噬影响评估其病理生理学意义。具体的研究内容分为以下几部分:第一部分脊髓小胶质细胞的培养以及缺氧环境模型的建立(一)实验方法:1、小鼠脊髓原代小胶质细胞的培养与形态观察2、小鼠脊髓原代小胶质细胞的分离与鉴定3、BV2小胶质细胞的的培养与形态观察4、小鼠脊髓原代小胶质细胞及BV2小胶质细胞缺氧环境模型的建立5、缺氧状态下,检测0-24小时,在不同时间点原代小胶质细胞及BV2小胶质细胞存活率6、缺氧状态下,检测0-24小时,在不同时间点原代小胶质细胞及BV2小胶质细胞死亡率(二)研究结果:1、小鼠脊髓原代小胶质细胞置于低氧培养箱中0小时,其生存率接近100%,随着缺氧状态下培养时间的延长,生存率进行性降低,缺氧状态下0小时,死亡率小于10%,随着时间延长,死亡率进行性升高。2、BV2细胞置于低氧培养箱中0小时,其生存率接近100%,随着缺氧状态下培养时间的延长,生存率进行性降低,缺氧状态下0小时,死亡率小于10%,随着时间延长,死亡率进行性升高。第二部分缺氧状态下脊髓小胶质细胞炎症因子的表达及低氧诱导因子的表达(一)实验方法:1、缺氧状态下,于0-24小时不同的时间点,使用ELISA方法检测脊髓原代小胶质细胞炎症因子IL-1β的表达水平2、缺氧状态下,于0-24小时不同的时间点,使用ELISA方法检测脊髓原代小胶质细胞炎症因子TNF-α的表达水平。3、缺氧状态下,于0-24小时不同的时间点,使用Western blot法检测脊髓原代小胶质细胞低氧诱导因子(HIF-1α)的表达水平。4、缺氧状态下,于0-24小时不同的时间点,使用PCR法检测脊髓原代小胶质细胞低氧诱导因子(HIF-1α)m RNA的表达水平。(二)研究结果:1、ELISA检测表明低氧环境明显增加了IL-1β蛋白水平的表达,0h时,小胶质细胞的炎症因子的表达较少,3小时后IL-1β的表达急剧升高,6小时达到顶峰,之后随着时间的延长,IL-1β的分泌逐渐减少。2、ELISA检测表明低氧环境明显增加了TNF-α蛋白水平的表达,0h时,小胶质细胞的炎症因子的表达较少,3小时后TNF-α的表达急剧升高,6小时达到顶峰,之后随着时间的延长,TNF-α的分泌逐渐减少。3、Western blot检测表明,低氧环境明显增加了低氧诱导因子(HIF-1α)的表达,当缺氧培育箱培育为0h时,低氧诱导因子的表达非常少,3小时后低氧诱导因子的表达明显升高,6小时达到顶峰,之后随着时间的延长,低氧诱导因子的分泌逐渐减少。4、PCR检测表明,低氧环境明显增加了低氧诱导因子(HIF-1α)在m RNA水平的表达,当缺氧培育箱培育为0h时,低氧诱导因子的表达非常少,3小时后低氧诱导因子的表达明显升高,6小时达到顶峰,之后随着时间的延长,低氧诱导因子的分泌逐渐减少。第三部分缺氧状态下脊髓小胶质细胞自噬相关蛋白LC3的表达研究(一)实验方法:1、缺氧状态下,检测0-24小时,在不同时间点,使用Western blot法检测脊髓小胶质细胞微管相关蛋白l的轻链3(LC3)和Beclin1表达变化。2、透射电子显微镜下观测自噬体囊泡的变化(二)研究结果:1、Western blot检测表明,低氧环境明显上调了LC3的表达,0h时,LC3的表达非常少,3小时后LC3的表达急剧升高达到顶峰,之后随着时间的延长,LC3的分泌逐渐减少。2、Western blot检测表明,低氧环境明显上调了Beclin1的表达,0h时,Beclin1的表达非常少,3小时后Beclin1的表达急剧升高达到顶峰,之后随着时间的延长,Beclin1的分泌逐渐减少。3、3小时后可以观测到小胶质细胞内含有双层囊泡形成,说明有自噬体形成。第四部分:缺氧状态下脊髓小胶质细胞自噬的调控机制(一)实验方法:1、缺氧状态下,于0-12小时,不同的时间点使用HIF-1α的抑制剂2ME2,抑制HIF-1α的表达,ELISA法检测脊髓小胶质细胞的炎症因子分泌的变化2、缺氧状态下,于0-12小时,不同的时间点使用HIF-1α的RNA阻断,抑制HIF-1α的表达,ELISA法检测脊髓小胶质细胞的炎症因子分泌的变化3、缺氧状态下,于0-12小时,不同的时间点使用HIF-1α的抑制剂2ME2,抑制HIF-1α的表达,Western blot法检测LC3和Beclin1的表达变化4、缺氧状态下,于0-12小时,不同的时间点使用HIF-1α的RNA阻断,抑制HIF-1α的表达,Western blot法检测LC3和Beclin1的表达变化5、缺氧状态下,于0-12小时,不同的时间点使用HIF-1α的抑制剂2ME2,抑制HIF-1α的表达,CCK-8法检测脊髓小胶质细胞的生存率变化。6、缺氧状态下,于0-12小时,不同的时间点使用HIF-1α的RNA阻断,抑制HIF-1α的表达,CCK-8法检测脊髓小胶质细胞的生存率变化。(二)研究结果:1、ELISA检测表明,缺氧状态下,使用HIF-1α的抑制剂2ME2,抑制HIF-1α的表达,脊髓小胶质细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和TNF-α表达量增加2、ELISA检测表明,缺氧状态下,使用HIF-1α的RNA阻断,抑制HIF-1α的表达,脊髓小胶质细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和TNF-α表达量增加3、Western blot检测表明,缺氧状态下,使用HIF-1α的抑制剂2ME2,抑制HIF-1α的表达,脊髓小胶质细胞LC3和Beclin1表达减少。4、Western blot检测表明,缺氧状态下,使用HIF-1α的RNA阻断,抑制HIF-1α的表达,脊髓小胶质细胞LC3和Beclin1表达减少。5、CCK-8检测表明,缺氧状态下,使用HIF-1α的抑制剂2ME2,抑制HIF-1α的表达,脊髓小胶质细胞的生存率降低。6、CCK-8检测表明,缺氧状态下,使用HIF-1α的RNA阻断,抑制HIF-1α的表达,脊髓小胶质细胞的生存率降低。总结缺氧状态下,小鼠脊髓小胶质细胞随着时间的延长,生存率逐渐下降,死亡率逐渐升高;低氧状态下,明显增加了低氧诱导因子(HIF-1α)以及炎症因子IL-1β和TNF-α的表达上调;同时低氧环境亦明显上调了LC3和Beclin1的表达;电镜下观察有双层囊泡形成,说明有自噬体形成;抑制HIF-1α的表达,炎症细胞因子IL-1β和TNF-α表达量增加;LC3和Beclin1表达减少;小胶质细胞的生存率降低。实验研究结果说明缺氧状态下,短期内自噬的适度表达,可以减少细胞死亡率,提供脊髓神经细胞保护作用。