【摘 要】
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本文制备了一种能够特异性识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的多克隆抗体,并建立了检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的间接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法;同时利用抗3-甲基喹噁啉-2-羧酸
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本文制备了一种能够特异性识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的多克隆抗体,并建立了检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的间接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法;同时利用抗3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体建立了胶体金3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫层析试纸条方法。通过对3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原、人工免疫原的设计与合成,成功制备了高效价和特异性的MQCA多克隆抗体,并建立了一种快速检测MQCA的间接竞争酶联免疫分析方法,通过对方法反应条件的优化,确定MQCA间接竞争ELISA最佳工作条件为:包被原包被量为0.25 μg/well;抗体稀释2000倍;HRP-羊抗兔IgG酶标二抗稀释25000倍;MQCA标准品与抗体稀释液为pH 7.4 PBS缓冲溶液;封闭液为0.5%脱脂乳粉;MQCA多克隆抗体与其结构类似物均无交叉反应,特异性良好。方法灵敏度(IC50)为 20.86±0.313 μg/L;方法检测限(IC15)为 1.68±0.043 μg/L;方法的板内变异系数(CV)小于10%,板间变异系数小于15%,说明方法精密度良好:通过样品基质干扰消除实验,确定牛、猪肉样品稀释10倍即可消除基质影响;在50、200、500μg/kg三个加标水平上,ELISA方法的回收率在90%-100%,通过HPLC法进行样品的确证实验,间接竞争ELISA方法与HPLC方法,对牛、猪肉两种样品的检测结果的相关系数均为0.9999,两种方法相关性良好,方法准确度较高。通过实验利用3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体对包被原进行优化筛选;制备了胶体金溶液,并以胶体金为标记MQCA单克隆抗体,建立了胶体金3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫层析试纸条方法,通过优化建立该方法的最佳工作条件为:胶体金溶液合成时0.2 mol/LK2CO3溶液添加量为10μL;抗体添加量20 μtL;金标抗体复溶工作液体积200 μL;通过实验对MilliporeHF135与90硝酸纤维素膜进行对比,结果显示选择90硝酸纤维素膜较好;确定金标抗体上样量1.2μL;上样缓冲溶液为pH7.0 PB缓冲液;包被原与二抗稀释液为pH7.0 PB缓冲液;包被原与二抗稀释倍数分别为95倍、15倍;方法检测限为1 μg/L;牛、猪肉样品提取液进行10倍稀释即可消除基质影响;方法在牛、猪肉实际样品中的检测限为10 μg/L。
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