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家族性高胆固醇血症(FH)是最为常见且最为严重的单基因代谢性遗传病;FH杂合子患者动脉粥样硬化(As)较正常人群进展快100倍；FH纯合子患者在幼年发病，治疗较为困难，多数在20岁前死于冠心病。因此FH是As和早发冠心病的最重要危险因素，加强对FH临床与基础研究不但具有现实意义，更对未来的基因研究有重要意义。目前我国临床确诊的FH患者多数得不到明确的基因诊断，尚无较可靠的治疗方案。
目的:为深入探索FH患儿临床表型和治疗特点，以及导致胆固醇水平增高的遗传机制，本课题对2例FH纯合子患儿进行临床研究和治疗随访；采用核苷酸测序筛查已知致病基因，采用全基因组扫描单核苷酸多态性(SNP)-单倍体连锁分析定位致病染色体候选区域，采用最新的外显子组重测序结合生物信息学方法定位新候选致病基因，并在家系成员中验证。本课题为FH患儿的病症管理和定位新基因积累经验，并揭示导致胆固醇增高的新分子遗传学机制。
方法:
1.对2个河南汉族FH家系先证者进行病史询问、临床体检、生化检测及心脏/大血管超声检查，结合家系成员发病情况分析结果，根据陈在嘉主编的《临床冠心病学》和美国诊断标准明确临床诊断，初步确定遗传模式；
2.对2家系FH纯合子患儿给予胆固醇合成抑制剂和吸收抑制剂等药物联合治疗并随访；
3.提取两家系核心成员基因组DNA(gDNA)，扩增导致FH显性遗传模式的基因LDL-R、apo B100和PSCK9，采用PCR-SSCP联合核苷酸测序方法，确定候选致病基因位点；
4.如此方法未发现致病基因，则提取家系成员gDNA，制备Illumina InfiniumHuman Linkage-12芯片，采用高通量测序平台(Illumina BeadArray)进行全基因组SNP单倍体扫描，应用连锁分析软件Linkage2.1和Genehunter2.1进行参数及非参数连锁分析，定位候选基因最小染色体范围；
5.进一步采用最新的外显子组捕获技术(SureSelect Target EnrichmentSystem)构建外显子文库，制备Flow Cell测序芯片，采用最新的高通量测序平台(Illumina HiSeq2000)对核心家系成员进行外显子组捕获重测序；继以NCBI发布的最新基因组数据库(GRCh37.p2)为参考序列，使用BWA软件将测序片段拼接成外显子组序列，以dbSNP129数据库为参考，使用Sam Tools& VCF Tools筛查基因变异位点(SNV)，结合自编perl软件程序进行SNV数据过滤和基因注释，筛选先证者及其父母共有的无义突变(NS)、剪切位点突变(SS)和编码区插入缺失突变(Ⅰ)基因，最终确定候选致病基因。
结果:
1.河南Ⅰ号和Ⅱ和家系先证者胆固醇水平极度增高，分别为19.79和21.23mmol/L，合并多发性黄瘤病和动脉As表现，可诊断为重症FH纯合子患者；河南Ⅰ号家系33名成员中有17名可诊断为FH杂合子患者；河南Ⅱ号家系47名成员中有11名可诊断FH杂合子患者；两家系具有常染色体显性遗传模式；
2.随访结果显示：联合降脂治疗较为安全；治疗后河南Ⅰ号家系先证者胆固醇水平下降27％，河南Ⅱ号家系先证者胆固醇下降不明显为6％，两先证者冠脉及大血管As改变随年龄增长而进展；
3.核苷酸序列分析发现：(1)河南Ⅰ号家系先证者LDL-R基因NM_001195798.1：c.97C>T(即第二外显子(E2)c.97C>T)杂合突变，导致第33位密码子氨基酸由谷氨酰胺(Gln)变成中止密码子(X)(NP_000518.1：p.Gln33X，Q12X)；核心家系成员测序验证发现先证者父亲同样存在该突变；Ⅰ号家系成员未发现apo.B100和PCSK9基因突变；(2)河南Ⅱ号家系先证者未发现导致FH显性遗传模式基因LDLR、apo B100和PCSK9任何致病性突变；
4.全基因组SNP扫描单倍体连锁分析确定了与河南Ⅱ号家系疾病关联的2个全新候选区域，分别在第3号和21号染色体：3q25.1-26.1(152，453，376-165，643，332 bp)长约13.2 Mb，参数分析LODS为2.70，非参数分析NPL值9.01；21q22.3-21qter(44，363，322-48，129，895 bp)长约4.3 Mb，参数分析LODS为2.70，非参数分析NPL值8.86；
5.外显子组重测序结果排除该区域存在单基因座纯合突变；在第3号染色体候选区域中筛选到6个基因存在复合杂合突变；在第21号染色体候选区域筛选出7个基因存在复合杂合突变。
结论:
1.两家系先证者均符合FH纯合子临床诊断，As改变随年龄增长逐渐加重；2家系成员多人符合FH杂合子诊断；
2.河南Ⅰ号先证者存在LDL-R基因NM_001195798.1：c.97C>T杂合突变，在国内较为少见；
3.河南Ⅱ号先证者及该家系成员未发现与已知的6种FH基因突变；
4.确定了河南Ⅱ号家系与疾病相关联的2个全新候选区域，分别为：3q25.1-26.1和21q22.3-qter；
5.将河南Ⅱ号家系候选致病基因初步定位于第3号染色体的6个基因和第21号染色体17个基因，有待于进一步分析。