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L-羧乙基海因酶（L-Carboxyethylhydantoinase）是海因酶的一类，能够可逆催化L-羧乙基海因或其衍生物开环水解的酶。通过L-羧乙基海因酶催化功能，不仅可以生产某些手性氨基酸如L-谷氨酸、L-茶氨酸等，而且通过海因环对α-氨基和α-羧基同时进行保护，是多肽合成中一种新型的保护基。因此L-羧乙基海因酶在氨基酸生产和多肽合成等方面都有广阔的应用前景。本实验室早期筛选到一株具有较高L-羧乙基海因酶活性的菌株Alcaligenessp.CW221,从该菌株的发酵液出发，纯化获得L-羧乙基海因酶，本文在此研究基础上对纯化工艺，L-羧乙基海因酶的基因克隆、表达、酶学性质以及生物信息进行了研究，主要研究内容如下： ⑴将Alcaligenes sp.CW221菌株发酵液经过细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Source15 Q强阴离子交换层析等步骤对L-羧乙基海因酶酶蛋白进行分离纯化，L-羧乙基海因酶的最终纯化倍数为11.929，酶活回收率为18.79％，单个亚基的相对分子质量约为50KD。对纯化的酶进行N端测序和MALDI-TOF/TOF测定，结果表明L-羧乙基海因酶是一种酰胺水解酶，其N端序列为NH2-Ser-Asp-Phe-Asp-Leu-Val-Val-Arg-Gly-Asn。 ⑵使用PCR技术，成功获得了L-羧乙基海因酶的基因序列。基因全长1365bp，可以编码455个氨基酸序列。构建了L-羧乙基海因酶的表达载体armd-his-pET22b，并将其导入了E.coli BL21，得到了重组菌E.coli BL21/amd-hispET22b.诱导后酶活为3.06 U/mL。经SDS-PAGE电泳验证表明，重组菌在50KD处出现明显条带，实现了L-羧乙基海因酶在大肠杆菌中的表达。优化了IPTG诱导表达条件。在诱导剂浓度为0.8mmol/L，诱导温度37℃，诱导时OD600约为0.7，诱导时间为8小时的条件下，酶活达到最高值。 ⑶L-羧乙基海因酶的基因序列进行了碱基同源性分析，发现其和酰胺水解酶的相似性高达99％。然后，以L-海因酶1GKR为模板，进行了同源建模。经分析，可信区间有84.6％的氨基酸残基，在不可信区间则有0.5％，其Verify-3D值为91.03％, Errat值为67.898。将L-羧乙基海因酶的结构和PDB数据库中已经存在的6个海因酶结构进行比较，发现有相同的保守序列PGXXDXXXH，该序列是结合金属离子的重要部分。 ⑸对重组菌的酶学性质进行研究表明:反应最适温度为55℃，在37℃以上温度稳定性都比较差，最适pH为9.0，pH为弱碱性时，稳定性较好。Fe2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Ca2+对酶反应有抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最大;Mn2+、Ca2+对酶反应有促进作用，1mmol/L的Mn2+使酶活提高212.0％。L-羧乙基海因酶的动力学常数分别为:Km=1.274mmol/L、vmax=0.7235mmol/(L*min)。对L-羧乙基海因有着底物专一性。