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口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth virus，FMDV)引起一种可感染猪、牛、羊等偶蹄动物的烈性传染病。该病严重危害家畜的生产能力和畜产品质量安全，世界各国都非常重视它的研究和防控。我国目前主要通过接种灭活疫苗及合成肽疫苗的方法来控制该病的流行，它们均具有较好的保护效果。但由于传统灭活疫苗存在着难以避免的安全隐患问题，而合成肽疫苗又存在着生产工艺复杂，成本较高等技术壁垒，所以研制一种安全、廉价、高效的口蹄疫疫苗势在必行。 近年来，人们对口蹄疫疫苗及其相关的研究工作主要从以下两方面开展，一方面是对口蹄疫病毒抗原表位的研究，研究者们已经在VP1结构蛋白上发现了某些确实能引起淋巴细胞扩增、加强体液免疫的肽段；另一方面是探索一种廉价、安全、使用方便的疫苗生产系统来生产口蹄疫疫苗，毕赤酵母表达系统因其自身诸多优点，目前己成为较热门的选择。 本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性，设计含O型FMDV抗原表位的多肽Polypeptide(PP)基因序列，采用毕赤酵母表达系统分泌表达PP，并研究表达产物的生物学活性。主要研究如下： 1.本文根据基因文库中O型FMDV VP1氨基酸及核酸序列，应用软件DNAman4.0分析各亚型各个毒株VP1基因序列的差异，设计一段含有T细胞抗原表位及B细胞抗原表位的肽段，两表位间用二肽接头连接。然后运用毕赤酵母密码子偏嗜性，设计并合成该肽段基因，基因连接于质粒pUC57上。采取聚合酶链式反应(PCR)法，以质粒pUC57-PP为模板进行了扩增。凝胶电泳分析显示，其条带分子量大小与理论分子量(203bp)大小相符。通过酶切、连接将O型FMDV PP基因连接到毕赤酵母表达载体pGAPZαA上，构建pGAPZαA-PP重组表达载体，再转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。 2.pGAPZαA-PP重组表达载体经限制性内切酶BinⅠ线性化后通过电穿孔法转入毕赤酵母细胞X33中。通过ZeocinTM抗性筛选及PCR检测后，获得高拷贝转化子。 3.重组毕赤酵母pGAPZαA-PP/X33分泌的表达产物经Tricine-SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定后显示，表达产物中有一分子量为8.0kDa左右的特异性条带，与理论值相吻合，且具有较好的生物学活性。 4.多肽疫苗免疫小鼠后，ELISA检测结果显示，该重组蛋白制成的疫苗能刺激小鼠产生针对O型FMDV的特异性抗体，而空载体组和阴性对照组无特异性抗体产生。安全性试验显示，该重组蛋白疫苗不会对小鼠产生毒副作用及应激反应。 综上所述，本研究在毕赤酵母X33中成功表达了O型FMDV抗原表位蛋白PP，Tricine-SDS-PAGE及Western Blot试验表明，该蛋白具有较好的免疫学特性；由该蛋白所制备的亚单位疫苗能够刺激昆明小鼠产生特异性抗体。所以，本研究为O型FMDV新型疫苗的研发奠定了一定的基础。