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铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是一种常见的淡水区水华蓝藻,我们发现M.aeruginosa PCC7806胞外分泌蛋白MrpC具有悬浮特性,Synechocystis PCC6803中也具有相同功能的胞外分泌蛋白,它们被认为是重要的悬浮影响因子,对认识蓝藻水华的形成和防治具有重要意义。目前在蓝藻遗传研究方面,未见铜绿微囊藻接合系统的相关报道。本文建立了铜绿微囊藻的接合转移系统,为内外源基因导入该藻提供了技术体系,对铜绿微囊藻分子遗传的研究具有重要意义。本文研究的主要内容和结果如下:
(1)克隆带信号肽的mrpC基因,构建PET-28a-mrpC载体,并进行了蛋白表达,得到的蛋白均为包涵体,未得到有活性的蛋白。
(2)构建了反义RNA转座子载体pEGFP-IS-m(针对保守序列),并尝试通过超声转化,把反义载体转入铜绿微囊藻。荧光显微镜下观察到了带有绿色荧光的藻细胞,但未筛到理想的转化藻。
(3)用盐析沉淀法对培养时间较长的培养物分离纯化得到一个约20kDa的Synechocystis PCC6803胞外分泌蛋白。通过MALDI-TOF-MS初步鉴定该分泌蛋白为通道分泌蛋白G(hofG)。根据实验结果,分泌通道蛋白G在150μg/mL的浓度时即可完全抑制藻细胞的下沉;对Synechocystis PCC6803的胞外分泌蛋白超声,煮沸等处理,均能使其悬浮能力丧失;其悬浮功能具有非特异性,对不同藻种均具有悬浮能力。对该蛋白进行了透射电镜的观察,其纤维状结构与MrpC相似。对Synechocystis PCC6803胞外分泌蛋白基因进行了克隆,并进行了蛋白表达。
(4)对铜绿微囊藻抗生素抗性浓度进行了研究,结果表明,在液体培养时选用40μg/mL Km,10μg/mL Sp,10μg/mL Sm可以很好的抑制野生藻的生长,而在固体平板上则需要双倍的浓度。
(5)建立了铜绿微囊藻接合转化体系,即通过接合转化的方法把pRL1383a及mrpC反义载体pRL1383a-m转入到铜绿微囊藻,成功获得了转化藻株。