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背景：
Bcr-Abl是引起慢性粒细胞性白血病(CML)的一种融合蛋白[1]，它由(9∶22(q34；q11)染色体易位形成的费城染色体(Philadelphia chromosome)编码[2，3]，超过95％的CML病人以及约30％的成人型急性淋巴细胞白血病(ALL)被检出为费城染色体阳性(Ph1+)[1]。Bcr-Abl融合蛋白属非受体酪氨酸激酶(TK)，它具有持续激活的酪氨酸激酶活性，能导致自身磷酸化和多条下游信号转导通路激活。
2001年美国FDA批准了第一个靶向治疗药物STI571(Gleevec，格列卫)，它是针对Bcr-Abl设计合成的一种特异性的酪氨酸激酶抑制剂，体外实验证明STI571与Bcr-Abl蛋白有很高的亲和性，它通过占据Abl蛋白激酶的ATP结合位点，阻止ATP与Abl结合[4]，从而抑制其激酶活性，阻断Bcr-Abl所引发的下游信号转导[5]。STI571的高效低毒为CML的临床治疗开辟了一条分子靶向治疗的新途径。目前STI571已成为费城染色体阳性的CML治疗的一线药物。但随着STI571的广泛使用，近年来发现，长期服用STI571的患者易产生耐药性[6，7]。耐药性的产生涉及多种机制[8-10]，包括多药耐药(MDR1)基因的过度表达；Bcr-Abl基因扩增；Bcr-Abl基因点突变和其他Bcr-Abl非依赖性生长信号转导通路克隆等，其中Bcr-Abl的T315I点突变是最早发现且最顽固的点突变[10]，约占所有突变的20％。体外及临床研究表明携有T315I点突变的CML对STI571不敏感。如何克服STI571耐药问题，开发新一代靶向治疗药物是当今肿瘤医学研究的重要难题[11]。近年来，已报导有Nilotinib(AMN107)、Dasatinib(BMS-354825)等酪氨酸激酶抑制剂对部分STI571耐受性的Bcr-Abl点突变病例有效，但他们对T315I点突变效果都不理想[12-14]。
HSP90是动物细胞中含量最丰富的分子伴侣，它在多种底物蛋白的稳定、成熟和活性发挥中起着关键的作用。与正常组织相比，在肿瘤组织中HSP90表达量高于正常细胞的2～10倍，并有报道HSP90能维持多种原癌蛋白的稳定[15，16]。因为肿瘤细胞表现为高度依赖于分子伴侣，所以HSP90被认为是有效的肿瘤治疗靶点。
Celastrol是一种从传统中药雷公藤中提取的活性小分子化合物，新近研究表明celastrol具有很强的HSP90抑制活性，并能下调多种HSP90的底物蛋白的表达[17]。通过高通量筛选，我们发现该化合物能有效抑制T315I点突变的CML细胞株增殖。本课题将进一步探讨它对T315I点突变的CML细胞的增殖抑制及杀伤机制，推进celastrol的临床应用转化研究。
方法：
1.MTS法及台盼蓝拒染实验测定celastrol对细胞的增殖抑制和杀伤作用
2.软琼脂克隆形成实验测定celastrol对肿瘤细胞的长期增殖抑制作用
3.流式细胞术测定celastrol导致细胞凋亡和对细胞周期的影响
4. Western blotting探讨celastrol引发CML细胞凋亡的机制，检测其对Bcr-Abl及其下游信号转导通路蛋白的表达及磷酸化及对其他凋亡相关蛋白表达的影响
5. Bcr-Abl野生型及T315I突变细胞BALB/c裸鼠荷瘤模型及药效实验
结果：
1.Celastrol抑制Bcr-Abl野生型及T315I突变CML细胞株增殖：MTS测定celastrol对三株CML细胞(KBM5、KBM5-T315I、K562)的IC50均在1.0μM以下；台盼蓝拒染计数法显示：以1.0～2.0μM celastrol处理KBM5、KBM5-T315I、K562三株CML细胞，CML细胞在24 h则表现出台盼蓝染色阳性。Celastrol能在纳摩尔浓度完全抑制细胞增殖，并呈浓度依赖性方式杀伤CML细胞。
2.Celastrol在纳摩尔浓度已能长效抑制CML细胞增殖：经800 nM浓度的celastrol处理24 h使CML细胞在软琼脂上克隆形成率减少50％以上。
3.经1.0～2.0μMCelastrol处理，使KBM5，KBM5-T315I，K562细胞呈明显的Annexin V和Propdium iodide染色阳性，说明细胞出现调亡。Celastrol引发Sub-G1细胞增加，进一步说明细胞凋亡现象，但不引起明显的细胞在各周期的分布改变。
4.Celastrol诱导细胞凋亡，在24 h内呈时间依赖方式促使cytochrome c释放；在48 h内激活caspase-3，造成其自身剪切，并剪切下游底物PARP。Celastrol呈剂量依赖方式下调HSP90底物Bcr-Abl及它其下游信号转导分子的磷酸化。同时celastrol还下调多种抗凋亡蛋白的表达。
5.荷瘤nu/nu BALB/c裸鼠实验表明celastrol可以明显抑制皮下接种KBM5和KBM5-T315I肿瘤的生长(P＜0.05)，造成肿瘤体积及重量与对照组间的明显差别，免疫组化结果显示celastrol明显降低肿瘤组织Bcr-Abl融合蛋白的表达。
结论：
Celastrol显著抑制KBM5、KBM5-T315I、K562细胞增殖，下调Bcr-Abl和AKT及下游信号转导分子的磷酸化水平，诱导CML细胞凋亡，可以明显抑制在体肿瘤的生长。