银耳G蛋白α亚基基因的克隆及其敲除载体的构建

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银耳,又称白木耳,是一种典型的二型态胶质食用真菌,富含多糖、蛋白质、维生素、无机盐,被誉为“菌中之冠”,具有极高的食用、药用及经济价值。  二型态现象在真菌界的分布较为广泛,具有二型态现象的真菌种类很多,除银耳目真菌外,目前研究得比较多的还有酿酒酵母和致病性真菌,如玉米黑粉菌、白假丝酵母等。银耳的二型态表现为酵母相与菌丝相在一定条件下的可逆互变,其表现形式为:(i)在培养的过程的过程中能形成丝状体型和链状的假菌丝;(ii)一对可亲和的担孢子配对后长出萌发管,融合并形成具有锁状联合的双核菌丝,纯菌丝在培养过程中因外界因子的刺激在其边缘处能形成单核或双核的酵母状节孢子。  G蛋白,又称鸟苷酸结合蛋白,是一个庞大的三体蛋白质家族,其异源三聚体由α,β,γ三个亚基组成,可与大量不同的受体及效应器相互作用。G蛋白对动物、植物和微生物的生长发育都起着重要作用,G蛋白的表达水平及其活性的改变都相应地调节都会细胞生理、生化及其相关基因的表达。G蛋白广泛分布于原核生物和真核生物中,其发挥作用主要依赖于α亚基,α亚基不仅具有参与受体结合和作用于下游效应分子的特异识别功能,而且还有结合鸟苷酸的能力和内源GTP酶活性。  为了解G蛋白α亚基在银耳基因组中的存在状况,为进一步阐明其在银耳生活史中的影响奠定基础,本实验以银耳菌丝为材料,通过简并PCR方法对银耳G蛋白α亚基基因进行扩增,再通过RACE和SEFA-PCR扩增出银耳Gα基因cDNA全长、DNA全长及银耳Gα基因上游和下游序列。结果显示本实验得到的得到的银耳G蛋白α亚基基因cDNA全长,其全长共1059bp,编码了352个氨基酸,相对分子量40172.64 Daltons,分子式为C1784H2835N489O539S13,cDNA片段推导的氨基酸序列属于P-loop_NTPase超家族的Gα亚家族,含有12个保守区。利用MEGA软件构建的进化树显示,银耳与与新型隐酵母距离最近,具有85%的同源性。银耳G蛋白α亚基DNA和cDNA全长对比结果显示,其含有8个内含子区。  此外,本实验利用重组PCR将潮霉素磷酸转移酶、5’同源臂和3’同源臂成功融合成敲除盒,以质粒pCAMBIA1300为基础骨架成功构建敲除载体PGA,从而对银耳Gα基因功能分析提供了基础。
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