大马士革黑种草组培再生体系的建立和遗传转化条件的摸索

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花的多样性是植物多样性的重要体现。对花的多样性及其产生机制的研究是植物进化生物学的重要内容。但是,常见被子植物中的模式物种基本上都属于核心真双子叶植物或单子叶植物,花部结构简单且相对固定,对它们的研究并不足以全面揭示花部性状多样化的原因和机制。因此,更多的模式植物尚需开发。毛茛科黑种草属(Nigella)植物由于系统位置特殊、花部结构独特、生长周期短和可操作性强等原因,是开展花部性状发育和进化研究的理想类群。然而,由于缺乏高效的组培再生和遗传转化体系,对该类植物的研究仍处于起步阶段。本论文在系统研究的基础上,为黑种草属的大马士革黑种草(N.damascena)建立了高效的组培再生体系,并摸索了对其进行遗传转化的条件。本研究主要内容包括:  ⑴无菌播种:通过比较0.1%升汞和1.5%次氯酸钠两种灭菌剂,以及光照有无后对种子萌发的影响,发现用1.5%次氯酸钠处理种子,并在暗培养条件下萌发较好,萌发率约为70%。  ⑵愈伤组织的诱导:分别以播种后5-6天萌发的种子,播种后15天无菌苗的下胚轴、子叶和根为外植体,分别比较3种植物生长调节剂(6-BA、NAA和2,4-D)在0、1、2和4 mg/L浓度条件下的19种组合对愈伤组织诱导的影响,发现以播种后5-6天萌发的种子为外植体,在MS+NAA2 mg/L+6-BA2 mg/L固体培养基中暗培养30天,效果最好。此条件下愈伤组织诱导速率最快且呈金黄色。  ⑶胚性细胞的分化和再生:分别比较3种植物生长调节剂(0.5 mg/L的NAA、IBA和2,4-D)在固体和液体培养条件下,以及液体培养条件下培养时间对胚性细胞分化和再生的影响,发现愈伤组织在MS+NAA0.5 mg/L液体培养基中悬浮培养50天能产生大量体细胞胚,将其转至MS固体培养基上后能产生较多的、具有完整根和芽的小苗,但也会产生部分无根的小苗。  ⑷炼苗移栽:将根芽俱全的小苗移栽到灭菌基质中培养,成活率约为50%,培养约3个月后可正常开花结果;无根苗可嫁接于实生苗上,成活率约为40%,培养2-3个月后也能形成正常的花和果实。对大马士革黑种草的组培再生体系总结如下:以1.5%次氯酸钠灭菌种子20min,播种于MS培养基上,在黑暗条件下萌发。以播种5-6天后的种子为外植体,采用MS+NAA2 mg/L+6-BA2mg/L固体培养基在黑暗条件下诱导愈伤组织。将培养1个月的愈伤组织转入MS+NAA0.5 mg/L液体培养基中黑暗条件下悬浮培养50天,再转至MS固体无激素培养基中,光照条件下培养即可长出小苗。1个月后,将芽和根发育正常的小苗移栽入灭菌基质中;将无根苗嫁接到实生苗上,约3个月后可开花结实。从无菌播种到再生苗开花结实整个过程约需要7个月。  ⑸以下胚轴和萌发种子为浸染材料:选取下胚轴和萌发种子作为农杆菌浸染材料,分别摸索不同预培养时间、不同菌液浓度和不同浸染时间对遗传转化的影响。结果发现,下胚轴处理后生长缓慢且变褐,但是部分GUS染色后有蓝色斑块;萌发种子处理后虽有少量愈伤组织生长,但是将其悬浮培养后无再生苗产生。  ⑹以悬浮培养细胞为浸染材料:以萌发种子诱导的悬浮培养细胞为浸染材料,通过不同的筛选方案后可获得再生苗。部分再生苗呈PCR阳性,说明外源基因可能已经整合进入大马士革黑种草基因组中。但是由于时间有限,此结果有待下一步验证。对大马士革黑种草现有的遗传转化体系总结如下:以萌发种子诱导的快速增殖的悬浮培养细胞为材料,用OD600=0.5~0.6的农杆菌茵液浸染10 min,共培养3天后于MS+NAA0.5mg/L+Carb300 mg/L+Hyg0~10 mg/L的液体培养基中悬浮并暗培养50天,再转至MS+Carb300 mg/L固体培养基上,光照条件下即可产生抗性再生苗。此过程大约需要3个月。
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