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目的：1、检测CHFR在卵巢癌、宫颈鳞癌中的表达,及其与临床病理特征的相关性；2、检测CHFR在肿瘤胞株中的表达情况,并进行去甲基化处理,以了解CHFR基因是否存在启动子甲基化；3、检测卵巢癌、宫颈鳞癌及肿瘤细胞株中CHFR基因5’-CpG岛(转录起始点、翻译起始点及启动子区)甲基化状态,探讨CHFR基因在卵巢癌及宫颈鳞癌中表达下调的机制。
方法：1、RT-RCR、Real Time PCR方法检测CHFR在卵巢癌、宫颈鳞癌表达情况；2、Real Time PCR方法检测多种肿瘤细胞株CHFR基因表达情况,应用5-杂氮-2-脱氧胞嘧啶(5-aza-2-dexyCytosine,CdR)处理肿瘤细胞株,观察处理前后基因表达的变化；3、荧光定量MS-PCR检测卵巢癌、宫颈鳞癌及肿瘤细胞株中CHFR基因5-CpG岛(转录起始点、翻译起始点及启动子区)甲基化状态,进行测序,寻找其甲基化位点。
结果：1、CHFR在正常卵巢组织中全部表达,在卵巢癌中表达缺失15.09％(8/53),表达量显著低于正常卵巢组织(P=0.0023),与分期、病理类型及复发无关(P>0.05)。2、CHFR mRNA在正常宫颈组织中全部表达,在宫颈鳞癌中表达下调,两组相比有显著差别(P=0.0008);并与分期呈负相关(r=-0.408,P=0.019)。3、CHFR在肺癌细胞株AGZY中无表达,其余肿瘤细胞株中均有表达。4、5-Aza-CdR处理后,CHFR在AGZY中恢复表达,表达量明显增加(P=0.001)。5、在正常卵巢及卵巢癌组织中均可检出转录起始点和翻译起始点甲基化片段及非甲基化片段,无明显差异(P>0.05),该区域甲基化与否与CHFR mRNA的表达之间无相关性(P>0.05)。6、在正常卵巢组织中均检出启动子区非甲基化片段(U56)的表达,而无甲基化阳性片段(M56)。卵巢癌中M56的检出率为20.75％(11/53)。11例M56表达阳性的卵巢癌标本中,8例同时伴有mRNA表达缺失。卵巢癌CHFR基因启动子区甲基化与mRNA表达之间显著相关(r=0.621,P=0.000)。测序证实卵巢癌组织中存在CHFR启动子区CpG位点甲基化。7、在正常宫颈组织中均未见启动子区甲基化阳性(M56)片段,仅见非甲基化阳性(U56)片段。宫颈鳞癌组织中启动子区甲基化率为9.09％(3/33)。在正常宫颈和宫颈鳞癌组织中存在显著差异(P=0.042)。宫颈鳞癌中CHFR基因启动子区甲基化与mRNA表达之间无明显相关(r=-0.348,P=0.294)。8、在所有细胞株中均可检测到CHFR基因启动子区甲基化片段,在肺癌细胞株AGZY中无非甲基化U56的表达,其余细胞株中均可见U56阳性条带。
结论：1、卵巢癌组织中CHFR表达缺失、下调,与卵巢癌分期、病理类型,复发无关,提示该基因参与了卵巢癌的发生过程,有可能是卵巢癌发生过程中的早期事件。2、卵巢癌中CHFR基因启动子区CpG岛异常甲基化是导致mRNA表达缺失、下调的机制之一。转录起始点、翻译起始点CpG岛的甲基化状态与基因表达无关。3、宫颈鳞癌组织中CHFR表达下调,与分期呈负相关,提示CHFR基因参与了宫颈鳞癌的发生过程。4、宫颈鳞癌中CHFR基因启动子区甲基化参与了其表达调控,但不是引起mRNA表达下调的主要机制。