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背景和目的： 脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离提取的一种具有多向分化潜能的干细胞，对缺血性疾病的治疗有积极作用，但相关机制的研究有待进一步深入。本实验目的在于探索局部移植人来源脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)对小鼠随意型皮瓣成活能力及血管新生效应的影响，分离培养人脂肪干细胞，用于小鼠随意型皮瓣模型，观察皮瓣组织微血管数量、皮瓣成活率及细胞因子水平的变化，从脂肪干细胞旁分泌作用刺激血管新生的角度，探索脂肪干细胞辅助皮瓣移植的作用机制。 方法： 1、hADSCs的分离、培养、鉴定及标记:利用郑州大学第五附属医院健康成人吸脂术后的脂肪混悬液，采用Ⅰ型胶原酶消化法，体外分离、提取hADSCs，经体外培养及传代，于显微镜下进行细胞形态学的观察，取第3代细胞运用流式细胞仪对细胞表面抗原标记物进行检测。另取第3代细胞进行成脂、成骨分化诱导培养，至第21d固定细胞并分别用油红O或茜素红对诱导的细胞进行染色，倒置相差显微镜下观察诱导结果。应用CM-Dil荧光标记第3代hADSCs，显微镜下观察染色情况。 2、实验动物与分组:清洁级(SPF)雌性4周龄小鼠30只，体重25-30g，按照随机数字表法分为2组:实验组（ADSCs组，n=15）于背部制备随意型皮瓣并将500μl密度为1×106个/ml的细胞悬液分三次注射于皮瓣的蒂部、中部、远端;对照组（PBS组，n=15）于背部制备随意型皮瓣并将等量PBS同法注射于皮瓣的蒂部、中部、远端。 3、小鼠背部随意型皮瓣模型的建立、细胞移植、标本采集及检测指标:于小鼠背部沿身体长轴方向设计蒂在颅侧的随意型皮瓣3cm×1.5cm，采用局部注射移植ADSCs;移植后7d，计算各组皮瓣成活率;移植后14d，取皮瓣组织，随机作冰冻切片CD31免疫荧光染色，荧光显微镜下观察皮瓣组织微血管分布情况，并对CM-Dil标记的ADSCs示踪;ELISA法检测皮瓣组织中VEGF水平;Westernblot法检测皮瓣组织中SDF-1水平。 4、统计学方法:所有数据均以均数±标准差表示，采用SPSSStatistics17.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验;以P＜0.05差异有统计学意义。 结果： 1、体外ADSCs分离、培养、鉴定和标记:提取的ADSCs贴壁生长，呈梭形成纤维细胞样，单层分布，均匀有序。流式细胞学检查示第3代ADSCs表面抗原表达比例分别为CD105（93.30±1.24）％、CD90（97.25±2.33）％、CD31(0.20±0.04)％、CD34(3.82±0.86)％、CD45(3.12±0.53)％、HLA-DR(0.81±0.09)％,同型对照均为阴性。成脂诱导21d后的ADSCs经油红O染色，细胞内可见成片分布的亮红色圆泡，提示胞浆内有脂滴形成。成骨诱导21d后的ADSCs经茜素红染色，可见岛状分布的橙红色颗粒，提示有沉积的钙结节。CM-DiI标记后即刻观察，在荧光显微镜下见标记后的ADSCs均显红色荧光，经消化、重悬后细胞呈球形，胞浆丰富，活性良好，CM-Dil标记阳性率大于90％。 2、皮瓣成活率比较情况:术后7d，成活皮瓣与坏死皮瓣间分界清晰，易被双盲观察者区别。实验组皮瓣成活面积为（3.78±0.16）cm2，成活率为（84±3.625）％;对照组皮瓣成活面积为(2.27±0.16)cm2，成活率为（72.2±3.406）％;两组皮瓣成活率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3、皮瓣组织中微血管密度的检测和CM-Dil荧光示踪:和对照组相比，实验组成活皮瓣内微血管的密度有明显的增加，实验组为每单位面积内（32.2±2.59）个，对照组为每单位面积内（12.8±3.11）个，两组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。镜下可见少量红色荧光细胞分布于皮肤组织和皮下组织深层内，未观察到典型的红色荧光与绿色荧光重叠现象。 4、皮瓣组织中细胞因子水平的检测:ELISA检测显示实验组和对照组的皮瓣组织中均含有VEGF，与对照组相比，实验组VEGF分泌量显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）;Westernblot结果显示，实验组和对照组SDF-1表达均呈阳性，实验组SDF-1蛋白表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1、ADSCs可以通过Ⅰ型胶原酶消化法分离提取，该方法简单、快捷，所提取到的细胞增殖能力强，具有多向分化潜能，基本符合ADSCs的特性。运用CM-Dil可以有效地对其进行标记，适用于进一步的动物体内移植实验。 2、ADSCs局部移植到随意型皮瓣后，可以增加缺血组织细胞因子VEGF、SDF-1的分泌，在局部形成更适合内皮系细胞定植和生长的微环境，进而促进皮瓣的血管新生，提高皮瓣成活率。