壳寡糖诱导烟草抗性相关基因的克隆和鉴定

• 作 者: 张付云
• 机 构: 中国科学院大连化学物理研究所
• 出 处: 中国科学院大连化学物理研究所
• 发表日期: 2007年01期
• 关键词: 壳寡糖 cDNA克隆 基因表达 亚细胞定位 转基因烟草

壳寡糖能有效的诱导植物产生抗病性。本实验室以枯斑三生烟草(Nicotiana tabacum var. samsun NN)为材料,应用mRNA差异显示技术获得96条差异条带,本论文实验从差异条带的筛选着手进行了以下工作:1.壳寡糖诱导抗性相关基因的筛选.对11个通过mRNA差异显示获得的cDNA条带进行了筛选,结果得到枯斑三生烟的11个没有报道过的cDNA的3端序列,其中一个cDNA片段与本塞姆氏烟草SKPl(Nb SKPl)高度同源,因有NbSKPl蛋白与抗病相关的报道,故对其进行深入研究。
2.NtSKPl全长cDNA的克隆.利用RACE的方法成功地克隆了.NtSKPlcDNA的5端核苷酸序列和全长cDNA,建立了NtSKPl蛋白的三维结构模式图；序列分析结果表明5非翻译区域具有转录增强子、光响应元件和一个热激响应相关的顺式作用元件；Southern blot方法分析NtSKPl基因在基因组中的拷贝数为单拷贝。
3.NtSKP cDNA在原核细胞中的表达.成功地建立了NtSKPlcDNA的原核表达体系；纯化出了NtSKPl-His-tag融合蛋白,并应用质谱分析鉴定了该cDNA编码的蛋白质确为NtSKPl蛋白。
4.NtSKPl在细胞中的定位。GFP荧光标记亚细胞定位结果显示NtSKPl-GFP融合蛋白通常分布于胞浆,在特定细胞状态时核区也有分布,和与其互作的26S蛋白酶体的分布方式一致。
5.初步进行了转基因烟草的筛选。为了进一步确定NtSKPl在植物生长发育过程及抗性中的作用,构建了NtSKPl的二元干扰载体,通过叶盘法转化烟草,现已筛选出含空载体的阳性对照转基因烟草,含NtSKPl干扰载体的转基因植株正在筛选中。