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目的：大型真菌作为药物使用在我国已有近千年的历史，它们普遍具有降低胆固醇、降血压等多种药理活性，尤其是它们的抗肿瘤作用最受人们关注。香菇[1entinusedodes(berk)sing]，属真菌门，它是世界上著名的食用真菌之一。近十年，国内外有关学者对香菇抗肿瘤作用进行了大量研究。目前，大多研究角度为：1、香菇子实体及其提取物的相关研究。而有关香菇菌丝发酵液及其提取物的研究较少。以香菇子实体作为研究对象，子实体的生长周期大约为10个月，费时费力。香菇C91-3是我课题组经多年筛选的一株其发酵液具有抗肿瘤、抗细菌作用的真菌，此发酵液中含有的多糖和氨基酸成分与子实体相似，但其发酵周期只需要5-7天，为工业化生产奠定了基础。2、香菇多糖的免疫调节机制的相关研究，有关香菇蛋白的抗肿瘤作用鲜有报道。利用蛋白质基本性质，我课题组对香菇C91-3发酵液中的蛋白进行了初步提取并进行抗肿瘤实验，显示此蛋白既具有体内抗肿瘤作用，亦具有体外直接杀伤肿瘤细胞作用。同时，我们也意识到香菇作为广泛应用的药用真菌，深入研究其有益蛋白组分有着重要的基础及临床应用意义。
方法：立足于前期研究基础之上，进行如下工作：利用凝胶层析技术分离香菇C91-3发酵液中提取的粗蛋白(LFP91-3)。按蛋白的分子量大小将提取蛋白分成3个组分(a、b和c)，经体外活性实验，证实C段蛋白(LFP91-3C)是抗肿瘤作用效果最强的蛋白组分，大量提取纯化进行体内实验。
(一)LFP91-3C对荷瘤小鼠的生存期影响的实验取24只BALB/C小鼠，分别予H22细胞(腹水型肝癌细胞株)腹腔荷瘤，荷瘤后随机将之分为3组：生理盐水(NS)组、环磷酰胺(CTX)组、LFP91-3C组。每组8只，荷瘤24小时后分别予以NS和CTX各0.4mg、LFP91-3C100μg每日一次，每次1ml/只，腹腔注射，连续5日。分别观察三组肿瘤细胞荷瘤小鼠的生存期。
(二)LFP91-3C对实体瘤块生长的影响及病理观察取24只BALB/C小鼠，分别予H22细胞右腋皮下荷瘤。分组及其用药剂量同上，右腋皮下注射小鼠，每日一次，连续10日。于接种肿瘤细胞后第13日处死小鼠，取瘤组织称重，并用福尔马林溶液固定，制备病理切片。研究LFP91-3C对荷瘤小鼠的抑瘤作用及机制。
(三)LFP91-3C对荷瘤小鼠免疫细胞和免疫因子的影响建立小鼠模型、分组和给药同组(一)。于接种肿瘤细胞第12天，各组小鼠分别摘除眼球取血，之后脱颈处死取脾。(1)NK细胞活性测定：将脾细胞放入Hanks液中剪成糊状，200目不锈钢细胞网过滤分成单个脾细胞，用Hanks液洗涤，调整浓度5×106/ml。96孔板中按实验孔、效应细胞对照孔、靶细胞对照孔分别加入脾细胞和YAC-1细胞各100μg，各设3个复孔，置37℃、5﹪CO2培养箱中饱和湿度培养20小时，离心弃上清，各孔加MTT应用液10μl，再继续培养4小时，加入溶解液MDSO100μl，充分吹打使紫色结晶完全溶解后，在酶标仪测吸光OD值。(2)淋巴细胞增殖反应实验：按上述方法取脾细胞，将制备好的脾细胞，加入96孔板，每孔200μl，每个实验孔再加ConA(50μg/ml)20μl，对照孔RPMI-1640培养液20μl，各设3个复孔，于37℃，5﹪CO2温箱中培养68小时，离心1000r/min10min，吸弃上清100μl，加MTT液10μl，培养4小时，加DMSO液100μl，充分吹打使紫色结晶完全溶解后使用酶标仪测OD值。(3)荷瘤小鼠血清IL-2含量的测定：如上所述摘除小鼠眼球取血，制备血清，用小鼠IL-2ELISA检验试剂盒，采用双抗体夹心酶联免疫检测法，根据标准品OD值绘制曲线，从标准曲线上查出待检标本中IL-2的含量。(4)荷瘤小鼠血清IFN-γ含量测定：方法同(3)。
结果：1.LFP91-3C能延长荷瘤小鼠的生存期，抑制肿瘤生长。对由H22肿瘤细胞所致的腹水型荷瘤小鼠，LFP91-3C组的存活期的平均值为：22.88天，较NS组13.25天(P＜0.05)和CTX组17.63天(P＜0.05)有显著延长。
2.LFP91-3C能抑制小鼠体内实体肿瘤生长，LFP91-3C组的抑瘤率为70.32﹪，CTX组抑瘤率为24.95﹪，LFP91-3C组抑瘤效果显著强于CTX组(P＜0.05)。病理切片上可见：NS对照组肿瘤组织生长旺盛，侵犯周围组织，肿瘤细胞排列紊乱，细胞体积较大，核增大，可见巨核、多核现象，核分裂像增多，局部有坏死。LFP91-3C组作用后肿瘤组织生长明显受抑制，肿瘤组织内部和间质可见大量炎细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，而且可见局部有大片坏死。
3.LFP91-3C能显著提高荷瘤小鼠的细胞免疫和体液免疫。(1)NK细胞活性：LFP91-3C组的NK细胞活性89.67±3.65ng。显著高于NS组NK细胞活性65.98±7.16ng。(2)淋巴细胞增殖率：LFP91-3C组的淋巴细胞增殖率44.40±4.30ng。显著高于NS组淋巴细胞增殖率34.57±3.50ng。(3)荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ的含量：94.59±5.40ng，51.02±4.51ng。LFP91-3C组的血清IL-2和IFN-γ明显增加，分别为127.38±3.89ng，66.44±3.66ng。
结论：本实验对香菇C91-3发酵液中的粗蛋白探索性的利用凝胶层析技术进行了初步提取、分离和纯化，按蛋白的分子量大小将提取蛋白分成3个组分(a、b和c)，经体外活性实验，证实C段蛋白(LFP91-3C)是抗肿瘤作用效果最强的蛋白组分，并进行体内实验。证实LFP91-3C能明显延长荷瘤小鼠的生存期并对实体肿瘤有明显抑制作用，还能通过激活机体的免疫系统提高体液免疫、细胞免疫方面的指标，来实现其抗肿瘤作用。本实验为进一步开发具有多功能的抗肿瘤生物新药提供理论依据。