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获得来源广泛、具有稳定表型和良好增殖能力的种子细胞是体外构建组织工程软骨并进行关节软骨缺损及其他软骨损伤修复的前提。异体软骨细胞与自体软骨细胞、骨膜细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等相比具有来源广泛、不给病人带来额外痛苦等优点，而猪的细胞、组织和器官常用于代替人体细胞、组织和器官移植。本研究以关中黑猪为实验动物，对软骨细胞分离、培养和鉴定方法及体外扩增的途径进行了探讨，并以所得的软骨细胞对组织工程软骨体外构建的技术方法进行了初步尝试。 试验采用 0.25%胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型胶原酶配合消化的方法分离关中黑猪耳廓软骨细胞，并在体外进行培养，同时相差显微镜下观察软骨细胞生长的形态学变化、测定细胞克隆率和冷冻复苏率、绘制生长曲线，并运用甲苯胺蓝染色和免疫组织学方法检测不同时期软骨细胞的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原分泌情况。结果表明：用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶配合消化的方法可以成功分离耳廓软骨细胞；软骨细胞在体外培养的过程中表现为多形性，有圆形、短梭形、多角形等；随着传代次数增多，软骨细胞逐渐向成纤维样细胞转变，并有少量肥大细胞出现；糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的分泌也随传代次数增加而减少。单纯游离细胞培养 3 代后细胞成纤维化较多，而与未完全消化的组织块共培养的细胞体外培养 6 代后大多数细胞能维持短梭形，仍可见细胞质中有一些分泌小泡。 另对关中黑猪耳廓软骨细胞在添加 10％FBS、5％BFF、10％BFF、20％BFF、5ng/mlEGF、20ng/mEGF 或 40ng/ml EGF 的 F12 培养液中的增殖和表型变化还进行了研究。结果显示：以 10%BFF 替代 FBS 作为培养液蛋白源培养软骨细胞，能促进其增殖和细胞外基质的分泌，与对照组相比差异显著(P<0.05)；添加 20ng/ml EGF 的培养液也能促进软骨细胞的增殖，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，但对细胞表型特征的变化没有影响；20ng/mlEGF 组增殖效果优于10％BFF 组，差异极显著(P<0.01)。 此外，试验还用所得软骨细胞在离心管中无支架培养构建工程化软骨进行了初步尝试。试验获得外观呈软骨样组织块 4 块，在用镊子夹取时其中 3 块碎裂。剩下的软骨样组织外观呈乳白色，直径约 3mm左右，略带光泽。 综上述试验结果，得出如下结论： 1. 采用 0.25%胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型胶原酶配合消化的方法能成功地从关 中黑猪耳廓软骨分离出具有活性的软骨细胞。<WP=7>2. 与未完全消化的组织块共培养可为软骨细胞的生长提供一个与正常生理 条件相似的生长环境，有利于软骨细胞经多次传代后的正常增殖和表 型维持。3. 用 BFF 替代 FBS 培养软骨细胞能较好地促进细胞增殖，并能维持软骨 细胞的表型，以添加 10％BFF的培养液促增殖效果最好。4. 添加 EGF 也能提高软骨细胞的增殖速率，但对软骨细胞去分化现象没 有明显的响，即不能抑制软骨细胞向成纤维样细胞的改变。5. 在离心管中无支架培养得到外观呈软骨样的组织块。