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沃尔巴克氏体(Wolbachia)是存在于节肢动物体内的一类呈母系遗传的细胞内共生细菌。该菌通过不同机制参与调控寄主的生殖活动,可诱导胞质不亲和(CI)、孤雌生殖(PI)、雌性化、杀雄、增强雌性繁殖力等生殖现象。过去的几年里,在Wolbachia菌的作用机理、种群生物学和进化方面做了比较多的研究,但主要集中在果蝇、蚊子和寄生蜂上。在鳞翅目中,关于Wolbachia的研究也有报道,蝴蝶和螟类中Wolbachia研究显示Wolbachia具有不同的生殖调控作用。先前关于家蚕中的研究认为家蚕中没有共生有Wolbachia菌。本研究在家蚕全基因组数据库和Wolbachia基因组序列的基础上,利用基因克隆、PCR、Southern杂交方法实验证明了家蚕中Wolbachia的存在,分析了Wolbachia的系统进化及水平传播；并通过抗生素消除Wolbachia实验研究了Wolbachia对家蚕的调控作用,主要研究结果如下1.家蚕和野蚕体内Wolbachia特有基因的克隆及信息分析本实验在不同地区的野蚕和不同品种家蚕个体总的基因组DNA中,均克隆获得了Wolbachia两个特异基因---wsp基因和ftsz基因。其中wsp基因片段长593 bp,编码197个氨基酸,具有一个结构域,该结构编码膜孔蛋白,介导微生物与宿主之间的关系。ftsz基因片段长571bp,编码189个氨基酸,具有两个结构域,分别是微管蛋白和微管蛋白C末端结构域,参与细菌的分裂。使用PCR检测方法,结果发现在大造生殖组织和体细胞组织中均有分布,并且差异不大。另外通过在家蚕总RNA水平检测wsp基因利ftsz基因的表达,结果没有发现阳性条带。2. Wolbachia的系统进化及水平传播的分析Wolbachia能够在不同的宿主间发生水平传播现象,也正因为如此,使得Wolbachia在自然界中分布广泛。本研究以ftsz和wsp基因序列构建系统发育树,结果显示家蚕与野蚕的Wolbachia位于系统发育树的B群,与寄生蜂类和鳞翅目物种共生的Wolbachia关系最为接近。根据Wolbachia的水平传播机制可以推测,野蚕体内的Wolbachia可能来自寄生蜂等膜翅目昆虫,而野蚕体内的Wolbachia可能会通过捕食作用转移到微小花蝽等蝽类体内。家蚕中的Wolbachia的来源可能有两个途径,一是野外采集桑叶上残留的Wolbachia,二是来自野蚕体内。考虑到Wolbachia母性传播和家蚕驯养的过程,第二个可能性比较大。3. Wolbachia基因水平转移的分析为了研究Wolbachia的基因是否发生水平转移,整合到家蚕或野蚕基因组中,首先以Wolbachia基因利用BLAST同源检索家蚕基因组数据库,结果显示在家蚕基因组上没有Wolbachia菌基因的同源序列,初步推测Wolbachia与家蚕之间没有发生基因的水平转移。进一步,利用wsp基因与蚕的基因组DNA进行Southern杂交试验,在家蚕大造品种中,没有检测到任何条带。表明Wolbachia与大造间没有发生基因水平转移。在云南野蚕、西昌野蚕、湖州野蚕、云南野蚕与大造杂交后代基因组杂交出不同的条带,显示Wolbachia和这三个野蚕之间发生了wsp基因的水平转移。4. Wolbachia对家蚕卵子发育的影响通过添食和注射实验,应用不同浓度,不同抗生素处理不同时期的家蚕,四环素和环丙沙星能够消除家蚕大造体内的Wolbachia,并且引起了家蚕卵子发育的异常,出现卵管短小,卵子个数明显减少,卵管中卵子排列异常,解剖过程中很难分开；并且全部不能化蛾。母代部分消除Wolbachia的个体,存活的F1代也出现卵子发育的异常,现象与处理的母代相同。抗生素处理的雄个体与未处理雌个体交配,其F1代产卵和孵化率均正常,因此认为消除Wolbachia对雄个体的生殖发育没有受到影响。为了进一步探索Wolbachia和宿主家蚕之间相互作用的分子机制,本研究检测了与精巢和卵巢发育相关的基因,包括家蚕卵黄原蛋白基因BmVg、家蚕卵黄原蛋白受体基因BmVgR、两性基因Bmdsx、精巢特异的β微管蛋白基因Bmtub、热激蛋白ATP酶同源体激活因子Bm44、精巢特异弹性蛋白基因BmTST和精巢特异的ATP酶抑制蛋白基因BmAIB基因。结果显示这些基因表达水平与Wolbachia感染无相关性。