【摘 要】
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鹿茸是哺乳动物中唯一可以完全再生的组织器官,受大量细胞生长因子的调控,生长速度极快却不会发生癌变,且成骨过程极易观察,因此鹿茸也就成为了一种研究器官再生及癌症治疗的理想模型。转化生长因子-β(transformation growth factor-β,TGF-β)具有广泛的生物学活性,是一类具有多功能的细胞生长因子。TGF-β超家族能够调节梅花鹿鹿茸快速生长和再生过程,对鹿茸的快速生长具有重要的
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鹿茸是哺乳动物中唯一可以完全再生的组织器官,受大量细胞生长因子的调控,生长速度极快却不会发生癌变,且成骨过程极易观察,因此鹿茸也就成为了一种研究器官再生及癌症治疗的理想模型。转化生长因子-β(transformation growth factor-β,TGF-β)具有广泛的生物学活性,是一类具有多功能的细胞生长因子。TGF-β超家族能够调节梅花鹿鹿茸快速生长和再生过程,对鹿茸的快速生长具有重要的促进作用,而Smad蛋白家族直接参与TGF-β超家族成员的信号传导,共同担负着调节细胞生长、分化、凋亡等过程。因此,探究Smad蛋白在鹿茸快速生长阶段的重要作用成为本研究的主要目的。本研究成功获得梅花鹿Smad2和Smad4基因序列,Smad2基因编码区(CDS)全长为1404bp,编码467个氨基酸,Smad4基因编码区(CDS)全长为1662bp,编码553个氨基酸,与牛、人、马和猪的Smad2和Smad4核苷酸序列同源性均在为94.00%以上。免疫组化结果显示,梅花鹿Smad2与Smad4基因在梅花鹿鹿茸顶端不同组织中均有表达且在不同组织层中存在明显表达差异,茸皮层表达水平最低,间充质层次之,软骨层表达水平最高。通过EdU与western blot试验检测转染miRNA-18a与miRNA-106b后对鹿茸软骨细胞体外增殖的影响和对Smad蛋白及其相关蛋白表达的影响。通过双荧光素酶活性检测Smad2与Smad4基因是否存在miRNA-18a与miRNA-106b的结合位点。EDU和Western blotting结果显示,转染miRNA-18a后鹿茸软骨细胞增殖受到抑制,Smad2蛋白及相关蛋白Smad1和Smad6的相对表达水平逐渐下降。转染miRNA-106b后鹿茸软骨细胞增殖受到促进,Smad4与Smad6蛋白的相对表达水平逐渐升高,Smad1蛋白的相对表达水平逐渐下降。双荧光素酶活性检测结果显示,Smad2是miRNA-18a调控的靶基因之一,Smad4是miRNA-106b调控的靶基因之一。为了验证miRNA-18a与miRNA-106b对梅花鹿鹿茸TGF-β信号通路相关基因表达的影响,本实验通过PCR Array技术对相关基因进行检测。PCR Array结果显示,miRNA-18a对组成TGF-β信号通路的TGF-β超家族、TGF-β受体、Smad蛋白家族三部分全部处于抑制状态,所以可知miRNA-18a可以抑制整个TGF-β信号通路的转导。miRNA-106b即可以促进TGF-β信号通路的转导也可以抑制TGF-β信号通路的转导,要将miRNA-18a与miRNA-106b的功能研究透彻还需进行大量的试验去证实。
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