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谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的重要菌株，广泛应用于医药、食品及饲料等行业。其生长快速，适应性好，具有作为新型细胞工厂的潜力，有着广阔的应用前景。然而相比大肠杆菌，酿酒酵母等模式生物，其基因修饰技术相对滞后。本研究首先针对目前基因修饰系统中转化子假阳性率高的问题，引入新的有效负筛选标记，并结合双链断裂重组技术，构建基因无痕修饰的双交换重组系统。在此基础上，借助大肠杆菌重组酶，实现了双链PCR片段对基因组的无痕修饰。 在谷氨酸棒杆菌中，主要采用质粒pK18mobsacB进行基因的修饰，但是sacB作为负筛选标记基因存在假阳性高的问题。本研究中首先通过比较谷氨酸棒杆菌野生型菌株（WT）与upp基因敲除型（WT-Δupp）菌株对致死物质5-氟尿嘧啶（5-FU）的耐受性，验证了upp基因作为负筛选标记的可行性。在相同Ptrc启动子调控下，upp较sacB有较低的假阳性率，降低了约10倍。证明了其更适合作为谷氨酸棒杆菌基因操作系统中的负筛选标记。并进一步确定了upp作为负筛选标记时，致死物5-FU的最佳筛选浓度为100μM。 通过构建含有upp负筛选盒子的通用质粒载体pCupp，IPTG诱导表达I-SceI核酸内切酶的辅助质粒pEC-XK99E-SceI-recET，进一步将upp负筛选标记与I-SceI核酸内切酶介导的双链断裂重组技术相结合，组建双交换重组系统，成功实现了目标基因ldhA的敲除。I-SceI核酸内切酶的表达对负筛选盒子弹出效率具有重要影响，最佳的IPTG诱导浓度为1.5 mM，最佳诱导时间为24 h，该条件下，负筛选盒子弹出的效率为3.68×10-5。 通过阿拉伯糖诱导辅助质粒pEC-XK99E-SceI-recET表达大肠杆菌重组酶RecE/RecT，转化敲除目的基因ldhA所需的PCR片段，首次在谷氨酸棒杆菌中实现了利用双链DNA片段对基因组的操作。辅助质粒pEC-XK99E-SceI-recET可通过无抗生素压力下传代消除，不会对细胞后续的基因操作产生影响。