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研究背景和目的： 肿瘤干细胞假说表明肿瘤是由一大群非肿瘤形成的肿瘤细胞中的一小群具有自我更新和肿瘤形成的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）构成的。CSC具有抵抗化疗药物的杀伤作用，在肿瘤复发的过程中，CSC因为其干细胞样特性可以产生肿瘤细胞中所有的细胞表型，导致了肿瘤的复发。越来越多的研究将 CSC作为肿瘤治疗的新的靶点。在一些已建立的肝细胞癌细胞系中，发现一小群具有 CSC特性的细胞，在原发肝细胞癌的样本中也检测到了具有 CSC表型和特性亚群细胞，考虑到 HCC患者的高复发率和病死率的临床特征，迫切需要在治疗上采取新的策略，尽管CSC的临床意义尚未完阐明，但对于 HCC的细胞组分的深入研究将有助于产生以特殊细胞群体（例如CSC）为靶点的治疗方式。 Suz12分子是多梳族蛋白复合体2（Polycomb repressive complex2，PRC2）的核心亚单位，PRC2主要是通过对组蛋白H3的第27位赖氨酸残基的三甲基化（H3K27Me3）修饰来实现对基因转录的表观遗传调控，而作为PRC2的核心组成部分，Suz12分子的表达高低往往与PRC2的活性密切相关，通过基因修饰的办法来过表达或敲除细胞内的Suz12分子，发现PRC2的下游H3K27me3水平会出现明显的升高或降低，PRC2分子中的任何一个核心组分对于整个复合体的功能都至关重要，关于PRC2与人类疾病相关性的研究都是从其中的核心亚单位入手的，PRC2对于胚胎发育过程中调控基因的时空特异性性表达发挥了重要的作用；近些年来，关于PRC2与肿瘤的研究表明PRC2对于细胞恶性转化的形成和肿瘤抑制基因的异常沉默状态的维持均发挥了重要的作用。 关于PRC2在肿瘤发生发展中作用的研究，以往集中在其具有催化活性的亚单位EZH2上，大量的研究表明EZH2在人类多种肿瘤如肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、直肠癌中均呈现高表达，并且EZH2的高表达和肿瘤的多种生物学功能如侵袭、转移、增值等密切相关。关于Suz12分子与HCC的研究报道甚少，有学者在人HCC样本中通过半定量PCR技术发现Suz12分子在癌中mRNA水平显著高于癌旁肝组织；而又有学者通过诱导肝细胞恶性转化模型、双转基因小鼠肝癌模型以及土拨鼠的病毒诱导肝癌模型中均发现 Suz12分子在肝癌的形成中表达水平逐渐降低，因此我们有必要结合我国HCC患者的病因和临床特征，研究PRC2中的重要亚单位Suz12分子在乙型肝炎病毒（Hepatitis B V irus,HBV）相关性HCC发生发展中的作用，以及Suz12分子在HCC中CSC的形成和维系所扮演的角色。 实验方法 1.载体及病毒构建：由吉凯基因构建和制备干扰人 Suz12和对照慢病毒载体、 2.建立稳定细胞系：构建干扰 Suz12分子和干扰对照的HCC-LM3、HepG2等稳定肝癌细胞系。 3.免疫磁珠分选：以CD133等作为肝癌干细胞标志物，磁珠分选出肝癌干细胞，比较Suz12在肝癌干细胞以及非肝癌干细胞中的表达差异，对HCC-LM3、HepG2及CSQ-PVTT进行悬浮培养，比较成球的上述细胞核贴壁培养的细胞Suz12分子的表达差异。 4．流式分选： 对感染干扰suz12及shsuz12-mock慢病毒载体的HCC-LM3和HepG2细胞根据表达的 GFP，分选表达 GFP阳性的上述细胞平铺至细胞培养皿继续培养并扩增。 5. Spheroid形成实验 将将HCC-LM3-shsuz12和HCC-LM3-Mock稳定细胞系的单细胞悬液接种于96孔低粘附板10天后观察两组间spheroid形成情况（包括成球的大小和数目）。 6.软琼脂克隆形成实验 将HCC-LM3-shsuz12以及HCC-LM3-shsuz12-mock细胞用2000μl/孔完全培养重悬，加入铺好Matrigel胶的6孔板中；置于37℃、5％CO2孵箱中培养，2周后于倒置显微镜下观察，计数形成克隆数目 7.裸鼠皮下荷瘤实验： 将干扰Suz12以及干扰对照的HCC-LM3稳定细胞系扩增后，细胞消化重并计数，以1*106细胞为标准接种裸鼠皮下，统计肿瘤发生率、瘤体体积、肺转移灶数目、并行皮下瘤组化检测相应分子变化。 8.资料收集及统计方法： (1)随机选取2004.9~2008.10年在我院行肝癌根治术的原发性肝细胞癌患者标本233例，制作组织芯片，并收集完善病史及随访资料;以免疫组化方法检测组织芯片标本中 Suz12的表达，并统计分析 Suz12的表达与肝癌患者各项临床特征（肿瘤大小、血管侵犯、肝内播散和远处转移等）及远期生存（无瘤生存率、总生存率和生存时间等）的关系。 (2)用SPSS16.0软件进行统计分析。结果以median(Q1-Q3)表示。χ2检验或 F isher确切概率法用来进行定性资料的比较。组间定量分析用 wilcoxon配对秩检验。相关性分析采用 spearman秩相关。累计生存和复发率的计算采用Kaplan-Meier，生存曲线用Log-rank绘制并进行生存分析。P<0.05视为统计显著 8.机制探索： 对于多梳族蛋白 Suz12分子而言，其为多梳族抑制复合体2（PRC2）中的一个重要的亚单位，PRC2主要是通过对组蛋白 H3的甲基化修饰来发挥其对基因转录的调控作用，我们通过对肝癌细胞系HCC-LM3以及HepG2进行干扰Suz12分子，我们发现和对照细胞相比干扰 Suz12分子后转录因子β-catenin的表达明显上调，而β-catenin进入细胞核作为Wnt信号通过激活的重要的标志在肝癌干细胞特性的启动和维持中均发挥了重要的作用。 实验结果: 多梳族蛋白Suz12分子在大部分人类肝细胞癌组织中的表达显著高于癌旁组织，Den诱导的大鼠肝癌模型也呈现出Suz12分子在癌中高表达的特点。 通过对肝癌病人组织芯片标本中 Suz12分子表达的高低差异的分析，发现Suz12分子高表达的肝癌患者较Suz12分子低表达或阴性表达患者预后更好（累积生存率和无病生存率），均有统计学差异。进一步和患者临床病理相关性分析发现其表达水平的差异和患者的TNM分期以及甲胎蛋白的多少相关 3．对HepG2、HCC-LM3进行低粘附培养，成球细胞和贴壁细胞相比Suz12分子在mRNA及蛋白水平上均明显下降，对HepG2、HCC-LM3及CSQ-PVTT进行磁分选CD133high以及CD133low的上述细胞，发现CD133high的上述细胞 Suz12分子的 mRNA水平显著低于CD133high的上述分子 通过慢病毒载体建立干扰Suz12以及干扰对照的HCC-LM3以及HepG2稳定细胞系，发现干扰Suz12后HCC-LM3细胞在克隆形成和低粘附培养成球能力均显著增强。 通过对HCC-LM3细胞干扰 Suz12分子后，发现和对照相比β-catenin在蛋白水平有明显升高，而在mRNA水平无明显变化。 结论: 本研究从病人样本、细胞水平以及动物体内水平证明多梳族蛋白Suz12在肝癌样本中的高表达，而在肝癌样本中Suz12分子的高表达预示患者的长期无病生存率更佳，具有肝癌干细胞或前体细胞特性的肝癌细胞中 Suz12分子表达下降，通过对肝癌细胞系干扰Suz12分子后的功能分析发现，Suz12分子干扰后细胞的低粘附成球和软琼脂克隆形成能力均增强，进一步发现Suz12分子可能是通过调控WNT信号通路抑制β-catenin的入核来发挥上述功能的。