论文部分内容阅读
植物基因工程在增强植物抗逆性、提高作物产量以及改良品质等方面发挥重要的作用,常常需要外源基因在受体植物中进行异源表达。而启动子可与转录因子结合并协调作用调控下游基因的表达模式及程度。并且,对启动子的深入研究还可以加强人们对植物生长发育各个阶段中植物内部调控过程的分子机制的了解,因此启动子已在植物基因工程中得到广泛地应用。有研究预测RIQ基因N末端的转运肽能够特异靶向叶绿体,并且存在高度保守且功能未知的结构域1118,该基因编码的蛋白能够特异定位于类囊体膜上,通过调节基粒堆叠的程度以优化捕光复合物II结构,最终对植物起到光保护的作用。本课题组前期从大豆基因组中分离得到Gm RIQ2基因,研究发现该基因CDS序列全长为585 bp,编码194个氨基酸,具备跨膜结构,属于膜蛋白,其蛋白定位于叶绿体。而且在植物光保护及抗旱调节中发挥作用,并推测可能参与种子产量的负调控过程。如通过对基因的启动子进行分析,可以更全面深入地研究基因功能。因此本研究以大豆垦丰16为材料,提取基因组DNA并运用PCR技术分离得到Gm RIQ2基因的启动子序列;构建植物表达载体并转化大豆及拟南芥;运用5’端缺失法获得三个不同长度的Gm RIQ2基因启动子缺失片段,分别构建缺失片段表达载体并转化拟南芥;通过生物信息学、组织化学染色、GUS酶活性检测及荧光定量PCR的一系列分析,对Gm RIQ2基因启动子的结构及功能进行初步分析,旨在明确该启动子的调控基础及其调控基因表达时其内部功能元件的调节作用,为研究Gm RIQ2基因的功能和作用机理奠定良好的科学基础。研究结果如下:1、通过PCR扩增获得长度为1661 bp的大豆Gm RIQ2基因启动子,命名为PGm RIQ2,通过Plant CARE在线分析网站发现该启动子序列中不仅含大量基础调控元件:TATA-box和CAAT-box,还存在生长素响应基序Aux RR-core,参与茉莉酸甲酯反应的响应基序TGACG-motif和CGTCA-motif,与脱落酸诱导有关的调控元件ABRE,种子特异性表达元件RY-element,厌氧感应调节元件ARE以及若干参与光反应的调控基序:ATCT-motif、BoxⅡ、G-box、GATA-motif和TCT-motif。2、构建Gm RIQ2基因全长启动子的植物表达载体,利用发根农杆菌介导转化大豆子叶节,GUS染色发现Gm RIQ2基因全长启动子能驱动GUS基因在大豆根系中表达,表明该启动子具有启动活性,并且其发根转化率和阳性诱导率与Ca MV35S启动子无明显差异。3、Gm RIQ2基因全长启动子的植物表达载体转化拟南芥,GUS组织化学染色发现Gm RIQ2基因全长启动子能驱动报告基因在转基因拟南芥全株表达,且在莲座叶维管组织中存在高效表达的优势,生育初期具有明显的时空表达特性。4、根据生物信息学分析结果,结合序列上顺式作用元件分布及元件功能预测,通过5’端缺失法,扩增获得三个长度分别为450 bp、284 bp和194 bp的Gm RIQ2基因启动子缺失片段。构建三个含Gm RIQ2基因启动子缺失片段的植物表达载体,采用花序浸泡法分别转化拟南芥,GUS染色表明Gm RIQ2基因启动子缺失片段均能驱动报告基因在拟南芥中表达,其表达水平与缺失片段长度正相关,但在莲座叶维管组织中仍具有表达优势。5、将获得的转基因拟南芥分别用50μM/L生长素、100μM/L脱落酸和100μM/L茉莉酸甲酯进行激素处理,用300μmolm-2·s-1光照强度处理,经GUS酶活性检测发现Gm RIQ2基因全长启动子可以应答生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯及光信号的诱导,并初步确定生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯的应答元件分别位于-1661～-450 bp、-450～-284 bp和-284～-194 bp,初步推断该启动子具有诱导型启动子特性。6、将大豆KF16分别用50μM/L生长素、100μM/L脱落酸和100μM/L茉莉酸甲酯进行激素处理,经q RT-PCR检测,结果表明Gm RIQ2基因受生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯的负调控。