小叶金露梅化学成分及其在SH-SY5Y细胞中的神经保护作用研究

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小叶金露梅(Potentilla parvifolia Fisch.)是蔷薇科委陵菜属落叶灌木,是一种传统的中藏药,广泛分布在我国的黑龙江、四川、甘肃、青海等地,主治寒湿脚气、利尿消肿、痒疹、外用治乳腺炎。前期关于小叶金露梅化学成分和药理活性的研究报道很少,因此本文对其进行了化学成分和活性研究。  论文以小叶金露梅的地上部分为原料,对小叶金露梅中的化学成分进行了系统的分离。将小叶金露梅地上部分(6.5kg),用70%乙醇加热提取,合并提取液减压浓缩,得到提取物,提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,减压浓缩,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位4个部分。利用多种色谱方法(正相硅胶、Sephadex LH-20凝胶、MCI凝胶、薄层制备、半制备-HPLC、HPLC、HSCCC等方法)对各萃取部位进行分离制备。并利用紫外光谱、1H-NMR和13C-NMR技术及对照文献数据对分离得到的化合进行结构鉴定,共鉴定了22个单体化合物,其中包括三萜类化合物6个(齐墩果酸、白桦脂酸、坡模酸、3β-羟基-30-降羽扇豆烷-20-酮-28-酸蔷薇酸、科罗索酸),黄酮类化合物9个(阿亚黄素、苜蓿素、槲皮素、银椴苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、紫云英苷、儿茶素、去氢双儿茶素A),单宁类化合物4个(原花青素B3、原花青素B6、原花青素B7和2,3,4,6-tetra-O-galloyl-D-glucose)和其他类化合物3个(β-谷甾醇、β-胡萝卜苷、绿原酸)。  论文以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为基础,建立了细胞诱导分化方法和冈田酸损伤处理的体外阿尔兹海默症(Alzheimers disease,AD)模型。通过MTT法检测了各化合物对细胞活力的影响,并通过Giemsa染色法和相差显微镜对细胞形态进行了观察,通过western blot实验验证了体外AD细胞模型的建立。随后,利用此细胞模型,通过相差显微镜观察细胞形态和western blot技术,考察了24个单体化合物和3个粗提物对tau蛋白磷酸化相关蛋白(tau-5和p-tau Ser262)的表达水平,从而评价各受试物在SH-SY5Y细胞中对抑制tau蛋白磷酸化的神经保护活性。结果显示坡模酸、蔷薇酸、科罗索酸、槲皮素、银椴苷、儿茶素、原花青素B1和原花青素B3具有神经保护活性。  此外本论文还利用流式细胞仪对各受试物对SH-SY5Y细胞的活性氧水平,线粒体活性氧和线粒体膜电势水平进行评价,考察了24个单体化合物和3种粗提物对细胞和线粒体相关指标的影响,结果显示白桦脂酸、苜蓿素、儿茶素、原花青素B3和原花青素B6具有保护抵抗细胞及线粒体氧化损伤的作用。这为进一步研究其神经保护作用机制奠定了研究基础。  本研究丰富了小叶金露梅化学成分研究基础,并探讨了这些化学成分的神经保护活性,为进一步开发利用小叶金露梅奠定了理论基础。
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