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新型聚合物/非离子表面活性剂双水相体系不但具有非离子型表面活性剂双水相体系胶团的特点,同时具有传统聚合物/聚合物双水相体系的优势。本文重点研究聚合物/非离子表面活性剂双水相体系的成相机制,以PEG/TritonX-100和PEG/Tween80双水相体系为代表,对聚合物/非离子表面活性剂双水相体系成相特性规律进行研究,以及对内在膜蛋白的实际分配能力考察。开展表面活性剂/聚合物双水相富集分离内在膜蛋白的研究,对拓展表面活性剂双水相体系分离纯化应用、推动内在膜蛋白分离、分析的研究进程以及膜蛋白质组学研究具有重要的意义。本文主要研究结果如下: 1.增加双水相体系的温度能够扩大成相区域。在0℃、20℃及40℃条件下,PEG20000/TritonX-100和PEG20000/Tween80成相区域随温度增加而增大,但Tween80对温度的敏感性不如TritonX-100。双水相体系成相区域随PEG分子量增大而增大。添加NaCl可以增加双水相体系的成相区域,而添加阴、阳离子表面活性剂则影响不大。下相非离子表面活性剂富集浓度大于上相聚合物富集浓度。 2.亲水性氨基酸Arg等分配在聚合物相,疏水性氨基酸Trp分配在非离子表面活性剂相。系线长度对氨基酸的分配有明显的影响,亲水性氨基酸的K随着系线的增加增大,疏水性氨基酸的K则减小。非离子表面活性剂相的疏水性大于聚合物富集相,通过对溶菌酶表面氨基酸残基分配系数的lnK与文献报道的氨基酸相对疏水性(RH)的线性关系得出PEG/TritonX-100和PEG/Tween80ATPS的疏水性因子(HF)的数量级为-10-2mol/KJ,表明下相TritonX-100及Tween80富集相比上相PEG富集相有更大的疏水性。蛋白表面氨基酸残基对蛋白在双水相体系中的分配起重要作用,通过溶菌酶表面氨基酸残基预测的溶菌酶分配系数(K)与实验K一致。非离子表面活性剂相能够富集高达99％的水不溶性生物分子。水不溶性胆固醇在PEG/TritonX-100和PEG/Tween80ATPS的K小于0.1,并且随系线长度和PEG分子量的增加而减小。 3.亲水性蛋白富集在聚合物相,而疏水性膜蛋白富集在非离子表面活性剂相。亲水性低分子量牛血清白蛋白、溶菌酶、细胞色素C和α-乳白蛋白富集在PEG相,大分子量IgG和疏水性膜蛋白胆固醇氧化酶分配在TritonX-100胶团相,增加系线长度使双水相固有疏水性增加,胆固醇氧化酶的K减小。富集在PEG相的溶菌酶比活力有所减小,而分配在TritonX-100相的溶菌酶比活力有所提高,分配在TritonX-100胶团相的IgG效价也有增大。说明非离子表面活性剂胶团具有稳定蛋白活性的作用。盐离子改变蛋白在双水相体系的分配系数,加入SDS或NaClO4引入相间电位能够增加BSA的K,减小溶菌酶的分配系数。 4.通过生长曲线,盐生盐杆菌第四天达到稳定期,OD600为2.0。对细胞破碎上清液加入PEG20000/TritonX-100ATPS分配,通过LC-MS/MS质谱鉴定,TritonX-100相富集PfkB域蛋白,β-内酰胺酶域蛋白,超氧化物歧化酶,烯醇化酶及视紫红质等膜蛋白。