论文部分内容阅读
[目的]
建立气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱分析组织脂肪酸和DNA甲基化方法，比较结肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织脂肪酸的相对含量变化以及DNA甲基化水平的改变，寻找脂肪酸代谢和DNA甲基化在肿瘤组织中的特点，探讨脂肪酸代谢以及DNA甲基化与肿瘤发生发展之间的联系，为研究脂类与肿瘤的发生发展关系和肿瘤诊断标志物提供科学依据。
[方法]
(1)组织脂肪酸提取以及分析：采用脂肪酸提取衍生一步法，在组织中加入正己烷和14％三氟化硼/甲醇，充氮气后密封，100℃水浴加热1小时后加入三重蒸馏水，然后吸取上清，用氮气吹干后，再用正己烷150μL定容，最后用气相色谱质谱仪分析组织脂肪酸含量。
(2)组织DNA提取：在组织中加入蛋白酶K进行消化，然后加入苯酚-氯仿进行除蛋白，最后加入乙醇把DNA沉淀下来，用紫外分光光度计进行DNA浓度以及纯度的检测。
(3)组织DNA裂解：DNA样品加入88％甲酸在140℃反应90 min进行裂解。
(4)气相色谱质谱分析DNA甲基化：裂解后的DNA氮气吹干后，加入BSTFA(1％TMCS)，乙腈和吡啶进行衍生，然后离心，取上清，然后用气相色谱质谱仪进行分析。
(5)液相色谱串联质谱分析组织DNA甲基化：裂解后的DNA氮气吹干后，用甲醇溶解后离心，取上清，然后用液相色谱串联质谱仪进行分析。
[结果]
(1)通过分析35例结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织的脂肪酸，比较肿瘤组织和癌旁组织之间脂肪酸的差异，SFA、18:0/18:1、20:2和n-6/n-3在肿瘤组织中的含量比癌旁组织的高且具有显著性差异，18:1、20:5、20:5/20:4、22:6/22:4在肿瘤组织中的含量比癌旁组织低也具有显著性差异。
(2)通过比较不同肿瘤分期的结直肠癌患者中脂肪酸含量，比较不同肿瘤分期的脂肪酸之间的差异，发现C期结肠癌患者肿瘤组织中18:2和n-6脂肪酸的含量比B期高具有显著性差异。
(3)在建立气相色谱质谱检测组织DNA甲基化方法时，通过正交实验优化胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的衍生条件，得到其最佳衍生条件为100℃下加入50μLBSTFA(1％TMCS)，40μL乙腈和10μL吡啶反应45min。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶衍生物在气相色谱质谱分析方法中容易分离，且最低检测限为0.05ng，日内RSD分别为2.11％和5.23％，日间RSD分别为4.80％和9.41％，相对回收率分别为88.52％和92.35％。
(4)在建立液相色谱质谱检测组织DNA甲基化方法时，通过乙腈和甲酸铵在亲水柱中达到分离，且胞嘧啶的线性范围为(1～100)ng/mL，相关系数为0.9974，相对标准偏差为0.70％～4.09％；5-甲基胞嘧啶的线性范围为(1～50)ng/mL，相关系数为0.9948，相对标准偏差为0.60％～4.81％。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的检出限为1pg，日内相对标准偏差分别为1.94％～2.83％，日间相对标准偏差为2.17％～4.44％，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加样回收率为86.52％～105.14％。
(5)通过液相色谱串联质谱分析结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中DNA程度，发现肿瘤组织中的DNA甲基化水平比癌旁组织的DNA甲基化低(P<0.05)，表示低甲基化有利于肿瘤的发生。另外比较不同肿瘤分期结肠癌患者组织DNA甲基化的差异，发现处于C期的结直肠癌患者中的DNA甲基化水平比处于B期的低(P<0.05)。
(6)通过分析组织中脂肪酸含量以及DNA甲基化程度，发现组织脂肪酸与DNA甲基化具有一定的相关性，如16:0、18:1、18:2、20:4、22:4、n-6、n-6/n-3和18:0/18:1在组织中含量或比值增加，其相对应的DNA甲基化水平则降低(P<0.05)。
[结论]
本文建立了气相色谱质谱和液相色谱串联质谱分析组织脂肪酸和DNA甲基化的方法，运用该方法分析了结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中脂肪酸以及DNA甲基化的程度。结果显示：与癌旁组织相比，肿瘤组织中18:1降低、n-6脂肪酸升高，n-6脂肪酸随着肿瘤分期的递增而增加；肿瘤组织中DNA甲基化水平显著降低；16:0、n-6系列脂肪酸在组织中含量的增加伴随着DNA甲基化水平的下降。这些结果表明某些脂肪酸和DNA甲基化的变化与肿瘤的发生发展密切相关，脂肪酸的代谢异常可能引起DNA甲基化的改变并导致肿瘤的产生。该结果为深入研究肿瘤诊断及治疗标志物提供了科学依据。