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卵巢上皮性癌（Epithelial ovarian cancer, EOC,简称卵巢癌）是女性生殖系统常见的一种恶性肿瘤,致死率在妇科肿瘤中占首位,五年生存率仅为30%。这是因为卵巢癌早期诊断困难,70%的患者确诊时已是晚期。而且晚期患者在经过肿瘤细胞减灭术联合以铂类为基础的化疗后,虽然得到缓解,但是60%的患者最终会复发,其中主要的原因是出现顺铂耐药。因此临床亟需新的卵巢癌肿瘤标志物和解决顺铂耐药的新的途径。间皮素（Mesothelin MSLN）是一种新发现的肿瘤细胞表面抗原,在正常组织中通常仅表达在体腔表面的间皮细胞,在恶性间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌等恶性肿瘤中过表达。间皮素基因编码的间皮素蛋白是一种以糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上的糖蛋白,全长69KDa,可被蛋白水解酶分裂释放出一个33KDa的可溶性蛋白,另外遗留下膜结合的蛋白（40KDa）作为细胞粘附分子。可溶性间皮素相关蛋白（Soluble mesothelin related protein SMRP）是42-45KDa的蛋白质,可能为膜结合间皮素的蛋白水解产物。由于SMRP可以释放入血且分子量明显低于卵巢癌标记物CA125,所以理论上灵敏度要高于CA125,从而有希望成为卵巢癌早期诊断的标记物。目前的研究证实间皮素可促进肿瘤细胞的增殖,增强其粘附、迁移的能力,但是还有很多生物学功能尚不可知。有研究发现间皮素在卵巢癌顺铂耐药组织中明显高表达,且与不良预后相关,提示间皮素的表达与化疗耐药有关。由此我们推断间皮素可能在卵巢癌顺铂耐药过程中发挥着重要作用,有望成为顺铂耐药治疗的新的靶点。本课题首先将间皮素与卵巢癌常用标志物CA125和新发现的重要卵巢癌标志物HE4做同期比较,并分别将三者联合检测,对间皮素的临床价值作出客观评价。然后从基因水平和蛋白水平分别检测卵巢癌耐药细胞株间皮素的表达。接着以SKOV3/cDDP细胞为例,应用RNAi技术沉默耐药细胞株表面间皮素的表达,进而通过MTT药物敏感试验、集落形成试验和流式细胞术来检测间皮素沉默后耐药细胞对顺铂敏感性的变化,并从耐药蛋白表达的改变,细胞内谷胱甘肽水平等方面探讨间皮素在顺铂耐药方面的可能作用机制。最后我们建立荷人卵巢癌耐药细胞株裸鼠移植瘤模型,用包装有间皮素siRNA的慢病毒液联合顺铂进行治疗,在体内水平进一步验证间皮素沉默后耐药卵巢癌组织对顺铂的敏感性,探讨间皮素沉默逆转顺铂耐药的可能性,从而为卵巢癌的耐药逆转研究提供一个新的思路。第一部分血清SMRP和HE4在卵巢上皮性癌诊断和病情监测中的临床应用目的:比较血清SMRP和HE4在卵巢良恶性肿瘤和健康志愿者的分布,结合CA125,分析三种标志物单独和联合检测的诊断效能,探讨血清SMRP和HE4在卵巢癌诊断和病情监测中的临床价值。方法:用酶联免疫吸附法测定44例卵巢癌患者,56例良性卵巢上皮性肿瘤患者和40例健康志愿者血清中的SMRP和HE4水平,化学发光法测定血清CA125,比较三种标志物在不同分组,卵巢癌不同病理类型、不同分化级别、不同分期及良性卵巢上皮性肿瘤不同病理类型的分布,比较三种标志物在卵巢癌术前术后的变化。绘制ROC曲线对三种标志物进行诊断效能评价。分析三种标志物联合检测的诊断价值。结果:1卵巢癌的SMRP、HE4和CA125水平均高于良性上皮性肿瘤和健康志愿者（P<0.05）,差别均具有统计学意义。2浆液性癌的SMRP、HE4和CA125水平均明显高于粘液性癌,差别有统计学意义（P<0.05）。3Ⅰ-Ⅱ期的SMRP、HE4和CA125水平均明显低于Ⅲ-Ⅳ期,差别具有统计学意义（P<0.05）。4 G3的SMRP、HE4和CA125水平明显高于G2、G1,差别均具有统计学意义（P<0.05）。5浆液性囊腺瘤和粘液性囊腺瘤的血清SMRP、HE4和CA125水平分布差别无统计学意义（P>0.05）。6进行了理想肿瘤细胞减灭术的22例患者术后的SMRP、HE4和CA125水平明显降低,与术前相比差别具有统计学意义（P<0.05）。7 SMRP的ROC曲线下面积（AUC）为0.861,其95%的可信区间为（ 0.778—0.944 ）; HE4的AUC为0.905 ,其95%的可信区间为（0.830—0.980）;CA125的AUC为0.984,其95%的可信区间为（0.969—0.999）。8根据ROC曲线,HE4具有最高的特异性（1）,SMRP次之（97.92%）,CA125最后（89.58%）;CA125具有最高的灵敏度（90.91%）,HE4次之（86.36%）,SMRP最后（77.27%）。9 Kappa一致性检验:HE4的Kappa值为0.897（P=0.000）,SMRP的Kappa值为0.791（P=0.000）,CA125的Kappa值为0.776 （P=0.000）。10比较三种标志物的联合检测:CA125分别与HE4、SMRP进行平行联合检测灵敏度最高:95.45%,HE4与SMRP平行联合检测特异度最高:97.92%,三者的联合并不能提高特异度。在系列联合检测中,三者的任意联合特异度均为1。结论:1卵巢癌的SMRP水平明显高于良性卵巢上皮性肿瘤和健康志愿者,浆液性癌的SMRP水平明显高于粘液性癌,随着分化级别的降低,病理分期的增加,血清SMRP水平升高。2卵巢癌的HE4水平明显高于良性卵巢上皮性肿瘤和健康志愿者,浆液性卵巢癌的HE4水平明显高于粘液性癌。随着分化级别的降低,病理分期的增加,血清HE4水平升高。3卵巢癌实施理想肿瘤细胞减灭术后与术前相比,血清SMRP和HE4水平均明显下降,这两种指标可作为卵巢癌病情监测的指标。4血清SMRP,HE4与CA125相比均具有较高的特异度,与临床诊断一致性方面:HE4明显优于SMRP和CA125,SMRP与CA125基本相当或略优于CA125。CA125无论联合HE4还是SMRP均可以明显提高灵敏度或特异度,不需要三种标志物联合。SMRP和HE4可在一定程度上补充完善CA125用于卵巢癌诊断和病情监测的缺陷。第二部分siRNA介导的间皮素沉默在逆转卵巢癌顺铂耐药过程中的作用目的:检测间皮素（MSLN）在卵巢癌耐药细胞株上的表达,观察MSLN沉默后耐药细胞株对顺铂的敏感性,验证MSLN沉默是否可逆转顺铂耐药,探讨MSLN在卵巢癌顺铂耐药中的可能作用及机制,加深对卵巢癌顺铂耐药机制的理解。方法:培养SKOV3和3AO及相应的耐药细胞:SKOV3/cDDP和3AO/cDDP。应用MTT技术检测细胞的IC50,计算耐药指数（耐药指数=IC50耐药细胞/IC50亲本细胞）。应用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术分别从基因水平和蛋白水平检测四种细胞株上MSLN的表达。应用RNAi技术将耐药细胞株SKOV3/cDDP中的MSLN沉默,建立稳定转染细胞株,分成三组细胞:①干扰组（SKOV3/cDDP-LV-MSLN-RNAi细胞）②阴性组（SKOV3/cDDP-LV-MSLN-neg细胞）;③空白组（SKOV3/cDDP细胞）。三组细胞分别加入顺铂构成实验组,不加顺铂者构成对照组。用MTT法测定三组细胞在顺铂作用48h时的抑制率,抑制率（%）=（1-OD值实验组/OD值对照组）×100%,用SPSS13.0软件计算IC50。用集落形成实验检测三组细胞在顺铂作用下的集落抑制率,集落抑制率（%）=（1-克隆实验组/克隆对照组）×100%。用流式细胞术测定顺铂作用48h时三组细胞的凋亡率,顺铂诱导的凋亡率（%）=凋亡率实验组-凋亡率对照组。用Westen Blot检测实验组三组细胞P-gp,GST-π蛋白的表达。用比色法测定细胞内GSH水平。结果:1 SKOV3/cDDP耐药指数为4.5,3AO/cDDP耐药指数为4.2,属于低度耐药。2实时荧光定量PCR结果:SKOV3细胞RQ值为1.228±0.259,SKOV3/cDDP细胞RQ值为1.933±0.252,3AO细胞RQ值为0.972±0.139,3AO/cDDP细胞RQ值为1.595±0.106,差别具有统计学意义（F=26.403,P=0.000）,其中与SKOV3/cDDP明显高于SKOV3,差别具有统计学意义（P=0.000）;3AO/cDDP高于3AO,差别具有统计学意义（P=0.000）;SKOV3/cDDP高于3AO/cDDP,差别也具有统计学意义（P=0.008）;SKOV3明显高于3AO,差别具有统计学意义（P=0.039）。3 MSLN蛋白表达结果:各细胞株的蛋白含量分别为:3AO为（0.115±0.078）,3AO/cDDP为（0.655±0.121）, SKOV3组为（0.309±0.130）,SKOV3/cDDP组为（0.902±0.137）。四种细胞株MSLN蛋白表达差别具有统计学意义（F=61.511,P=0.000）,其中SKOV3/cDDP明显高于SKOV3,差别具有统计学意义（P=0.000）;3AO/cDDP明显高于3AO,差别具有统计学意义（P=0.000）;SKOV3/cDDP高于3AO/cDDP,差别有统计学意义（P=0.000）;SKOV3明显高于3AO,差别具有统计学意义（P=0.000）。4慢病毒转染SKOV3/cDDP细胞转染效率为80-90%,干扰效率为95.72 %。5实验组三组细胞暴露于顺铂48h后,各组细胞抑制率均随顺铂浓度的增加而升高,其中干扰组增加最显著。空白组的IC50为（5.365±0.259）mg/L,阴性组的IC50为（5.248±0.422）mg/L,干扰组的IC50为（2.661±0.158）mg/L ,三者相比差别具有统计学意义（F=77.851,P=0.000）,其中干扰组的IC50明显低于其他两组（P=0.000）,其他两组IC50相比差别无统计学意义（P=0.651）。干扰组细胞对顺铂的敏感性提高了约2.01倍。6空白组、阴性组和干扰组的集落抑制率分别为（44.683±3.767）%,（45.488±3.303）%,（64.56±2.904）%,三组相比差别具有统计学意义（F=67.935,P=0.000）,干扰组的集落抑制率明显高于其他两组,差别具有统计学意义（P<0.05）,阴性组和空白组的集落抑制率无统计学差异（P=0.683）。7流式细胞术凋亡率:空白组、阴性组和干扰组顺铂诱导的凋亡率分别为（19.667±5.417）%,（18.733±7.057）%,（39.867±5.463）%,三组相比差别具有统计学意义（F=11.774,P=0.008）。干扰组顺铂诱导的凋亡率明显高于其他两组,差别无统计学意义（P<0.05）,其他两组相比差别无统计学意义（P=0.85）。8空白组、阴性组和干扰组三组细胞P-gp蛋白含量分别为（0.868±0.153）,（0.796±0.105）,（0.764±0.103）,三组细胞相比差别无明显统计学意义（F=1.322,P=0.291）。9空白组、阴性组和干扰组三组细胞GST-π的蛋白含量分别为（1.266±0.137）,（1.248±0.135）,（0.485±0.163）,三种细胞相比差别具有统计学意义（F=65.706,P=0.000）。其中干扰组的GST-π水平明显低于阴性组和空白组（P<0.05）,阴性组和空白组相比差别无统计学意义（P=0.820）。10空白组GSH含量为（45.993±5.726）nmol/mg,阴性组GSH含量为（44.971±3.824）nmol/mg,干扰组GSH含量（24.743±4.659）nmol/mg。三组相比差别具有统计学意义（F=49.876,P=0.000）,其中干扰组明显低于其他两组（P<0.05）,其他两组无统计学差异（P=0.674）。结论:1从基因水平及蛋白水平上证实了耐药细胞株表面的间皮素表达明显高于敏感细胞株。2浆液性卵巢癌细胞株的间皮素表达水平高于粘液性卵巢癌细胞株。3间皮素沉默后卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性明显增强,间皮素在一定程度上逆转顺铂耐药。4间皮素沉默逆转顺铂耐药的可能机制:间皮素沉默通过下调GST-π蛋白的表达,降低耐药细胞内谷胱甘肽的含量,减少谷胱甘肽与顺铂的结合,顺铂作用增强,从而逆转耐药。5间皮素沉默逆转耐药的作用机制较复杂,可能多种因素参与此过程。第三部分siRNA介导的间皮素沉默联合顺铂治疗耐药卵巢癌裸鼠移植瘤的效果目的:观察MSLN沉默后裸鼠移植瘤对顺铂敏感性,进一步阐明MSLN在卵巢癌顺铂耐药中的作用。方法:建立荷人卵巢癌耐药细胞裸鼠腹腔移植瘤模型。将SKOV3/cDDP细胞接种于裸鼠腹腔,成瘤后用包装有间皮素siRNA的慢病毒液和顺铂进行治疗,分成六组:干扰组、干扰+cDDP组、阴性组、阴性+cDDP组、空白组和cDDP组。比较6组裸鼠的一般状况,生存期。裸鼠解剖后比较6组裸鼠的移植瘤数目和重量,用流式细胞术测定6组裸鼠移植瘤组织的凋亡率,单纯由顺铂诱导的凋亡率用ΔA表示,ΔA=加顺铂组的凋亡率-加PBS组的凋亡率,用Western Blot测定间皮素的干扰效率。结果:1干扰组的移植瘤数目及重量均显著少于阴性组和空白组（P<0.05）,干扰+cDDP组的移植瘤数目及重量最少,明显少于其他5组,差别具有统计学意义（P<0.05）,阴性组的移植瘤数目及重量与空白组相比差别无统计学意义（P>0.05）。2干扰组、阴性组、阴性+cDDP组、空白组和cDDP组的裸鼠均在接种肿瘤细胞后30天内全部死亡,中位生存期分别为28,26,27,25,25天,其中干扰组的中位生存期长于其他4组,差别具有统计学意义（P<0.05）。干扰+cDDP组的中位生存期为38天,与其他5组相比生存期明显延长（P=0.000）,差别具有统计学意义。3干扰组、干扰+cDDP组、阴性组、阴性+cDDP组、空白组和cDDP组移植瘤组织的MSLN蛋白含量分别为0.115、0.121、0.855、0.864、0.876、0.869,干扰组和干扰+ cDDP组的干扰率分别为86.87%、86.08%。4流式细胞术测凋亡率:干扰组的凋亡率高于阴性组和空白组,差别具有统计学意义（P=0.000）,干扰+cDDP组的凋亡率明显高于阴性+cDDP组和cDDP组,差别也具有统计学意义（P=0.000）。阴性组的凋亡率与空白组相比差别无统计学意义（P=0.907）,阴性+cDDP组的凋亡率与cDDP组相比差别无统计学意义（P=0.837）。单纯由顺铂诱导的凋亡率干扰组（40.96±4.746）%明显高于阴性组（19.88±4.356）%和空白组（19.26±4.746）%,差别具有统计学意义（P=0.000）。结论:1用包装有间皮素siRNA的慢病毒载体成功将移植瘤组织间皮素沉默,间皮素沉默本身能抑制肿瘤细胞的生长,促进细胞凋亡,肿瘤生长速度减慢。2对于耐药卵巢癌组织,顺铂对移植瘤几乎无治疗作用,凋亡率较低,但与间皮素沉默联合应用后,抗肿瘤作用明显增强,且大于两者之和,说明间皮素沉默后增强了移植瘤组织对于顺铂的敏感性,增加了顺铂的细胞毒作用。