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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的家畜和野生动物发病的一种急性传染病,猪是其主要的宿主,因此对猪的危害最大。猪伪狂犬病病毒是当前对我国猪场造成重大损失的主要病毒之一。目前,国内尚无治疗PR的有效药物。本实验室通过分离获得PRV-GD2013猪伪狂犬变异毒株,利用同源重组技术构建不含标记基因(EGFP)的gI/gE双基因缺失毒株。对重组伪狂犬病病毒免疫性评价进行初步研究,为研发伪狂犬疫苗提供材料。研究内容及结果如下:(1)本研究于2013年3月在广东某猪场采集疑似伪狂犬病的猪脑组织。对脑组织进行病毒分离,通过透射电镜观察及PCR扩增gB和gE序列,并进行序列测定。结果表明,透射电镜显示该病毒粒子具有典型的疱疹病毒结构,PCR可以扩增出伪狂犬病病毒gB和gE基因,经序列分析和生物学特性鉴定,证实该分离毒株为我国近几年流行的PRV变异株,并将其命名为PRV-GD2013株。(2)伪狂犬病病毒gI/gE双基因缺失载体的构建:以GD2013株伪狂犬病病毒的DNA为模板,PCR分别扩增出gI、gE两条片段,用作转移载体的上下臂,同时从pEGFP-C3质粒中扩增出CMV-EGFP-SV40 polyA信号序列片段。然后,通过Over-lap方法分别扩出gI-EGFP-gE和gI-gE两条片段,并通过同源重组方法将这两条片段分别组装于pBluescript KS(+)载体中。从而获得pBLE-gI-EGFP-gE转移载体和pBLE-g I-gE转移载体。将PRV-GD2013、pBLE-gI-EGFP-gE转移载体和Lipofectamin?2000转染试剂共转染BHK-21细胞,待出现80%细胞病变时收获病毒。通过空斑纯化法筛选得到重组病毒PRV-GD2013-△gI/gE-EGFP。然后将PRV-GD2013-△g I/gE-EGFP病毒、pBLE-gI-gE转移载体和Lipofectamin?2000转染试剂共转染BHK-21细胞,空斑纯化法筛选得到重组病毒PRV-GD2013-△gI/gE。通过PCR序列分析结果表明,PRV-GD2013-△gI/gE在gI和gE基因内部缺失2169bp。(3)缺失毒株生长特性及免疫效力的研究:对gI和gE双基因缺失毒株的生长特性及免疫效力的研究发现,PRV-GD2013-△gI/gE和PRV-GD2013在BHK-21细胞上的最高滴度为108.00TCID50,没有差异。将不同剂量的PRV-GD2013-△gI/gE接种仔猪(n=5),接种后无任何异常的临床症状,产生的PRV特异性抗体水平明显高于Bartha-K61疫苗免疫猪。并且PRV-GD2013-△gI/gE免疫猪攻毒后无临床症状和病理变化,均得到完全保护,但是Bartha-K61疫苗免疫猪攻毒后出现临床症状,未得到完全保护。上述结果表明,PRV-GD2013-△gI/gE对猪具有良好的免疫原性,是一株很好的PRV缺失疫苗候选株。