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研究背景我国在世界上食管癌的发病率、死亡率均居首位。在食管癌发生的早期,癌细胞对周围组织的侵袭以及向邻近、远端淋巴结、器官的转移成为了食管癌患者难以治愈和远期死亡率居高不下的关键。因此,对于恶性肿瘤侵袭转移机制的进一步研究,阐明引起食管癌细胞侵袭、转移发生的基因调控及蛋白分子作用机制,以开发出抑制或终结此过程的特效药物成为当前世界医学界研究的热点课题。肿瘤转移是导致恶性肿瘤复发和难以根治的重要原因,此过程贯穿于组织病理的各个阶段,上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在整个进展过程中起到潜在的重要作用。研究发现,EMT在胚胎发育、组织器官的形成、机体损伤修复、器官纤维化等过程中均扮演着关键角色。另外,EMT过程也是肿瘤发生侵袭转移过程中的一个重要事件。众多的细胞内外信号传导通路参与了EMT过程,涉及到众多基因的表达变化,如STAT3信号通路、Snail信号通路、Wnt通路等是与EMT的发生相关的最为经典细胞分子信号通路。近年来,大量研究表明缺氧相关细胞信号转导通路在EMT的发生过程中也起到非常显著的作用。缺氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在肝癌、乳腺癌、胃癌以及神经胶质细胞瘤等多种恶性实体肿瘤中普遍存在,但在常氧条件下均会经细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径降解,只有当实体肿瘤生长到一定程度之时,肿瘤细胞的生长失去控制,最终肿瘤组织将会处在相对缺氧微环境当中,HIF-1方可稳定表达。HIF-1α是HIF-1的活性亚基,受缺氧信号诱导调控,必须与HIF-1β结合形成稳定的异源二聚体才能发挥转录因子的作用。当肿瘤细胞缺氧发生时,HIF-1α在基因与蛋白水平的高表达,同时伴随E-cadherin的下调和Vimentin的上调,这种现象在多种实体肿瘤发生、发展的过程中已被证实。近年来,众多学者在对由HIF-1α介导的基因转录调控相关研究中取得了巨大进展。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一种由单核/巨噬细胞、纤维母细胞、B/T淋巴细胞、胶质细胞、上皮细胞产生的多功能细胞因子,能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化以增强其功能,参与了机体的免疫应答、炎症反应以及机体造血等多种生理、病理过程。当前研究发现,乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多种实体肿瘤组织中IL-6也高表达,在肿瘤的增殖、转移、凋亡等过程中起重要作用。IL-6的高表达可以通过IL-6/GPl30受体系统显著激活STAT3,从而调控STAT3下游基因的表达,引起上皮源性肿瘤细胞出现间质转化。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)广泛存在于从果蝇到人多种生物的各种组织中,对正常细胞、癌变细胞的生长、分化均具有显著调节作用。人类TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型,其中TGF-β1在体细胞中的表达量最高,在胚胎发育、组织修复、机体炎症反应以及肿瘤发生、进展等多种生理、病理过程中起着重要作用。目前,在TGF-β与原癌基因表达关系中TGF-β1被认为作用最为重要,在众多TGF-β1诱导体外培养的实体肿瘤细胞发生EMT的研究中,发现TGF-β1是引起上皮源性实体肿瘤细胞发生EMT作用最为强烈,效果最为显著的细胞外作用因子之一。既往研究肿瘤细胞发生EMT时需添加外源性的TGF-β1、IL-6进行刺激,而诱导完成后细胞可以通过自分泌TGF-β1、IL-6来维持EMT状态。本实验室之前研究发现,缺氧能够成功诱导食管癌Eca-109细胞发生EMT。此外,还发现使用外源性的TGF-β1、IL-6对体外培养的食管鳞癌EC-1细胞进行刺激,成功诱导该细胞发生了EMT,推测在缺氧条件下食管癌细胞发生的EMT转化的过程,可能与其产生和分泌更多的TGF-β1及IL-6相关。本次研究过程中采用科学的研究方法建立了食管鳞癌Eca-109细胞的体外培养化学性缺氧模型,阻断了HIF-1α基因的表达;对缺氧条件下TGF-β1、IL-6的m RNA表达水平和蛋白分泌量的变化进行了检测,同时检测了缺氧对EMT相关基因E-cadherin、Vimentin m RNA与蛋白表达水平的影响;最后,对HIF-1αsi RNA转染后食管鳞癌Eca-109细胞体外迁移和侵袭能力的变化进行了检测。第一部分细胞缺氧模型的建立及HIF-1α基因阻断研究方法1.调整培养液中Co Cl2的终浓度为150μmol/L,培养食管鳞癌Eca-109细胞建立化学性细胞缺氧模型,观察化学性缺氧状态下食管鳞癌Eca-109细胞形态学改变及其对HIF-1α表达的影响。1.1倒置显微镜:观察150μmol/L Co Cl2培养液培养食管鳞癌细胞Eca-109模拟缺氧环境,并对Eca-109细胞在缺氧0h(常氧)、3h、6h、12h、24h、48h形态学改变,确定最佳缺氧作用培养时间(24h)。1.2 Real-time PCR:检测食管鳞癌Eca-109细胞在不同的缺氧时间0h(常氧)、3h、6h、12h、24h HIF-1αm RNA的表达情况。1.3 Western bloting:检测食管鳞癌Eca-109细胞在不同的缺氧时间0h(常氧)、3h、6h、12h、24h HIF-1α蛋白的表达情况。2.HIF-1αsi RNA转染管鳞癌Eca-109细胞,观察不同HIF-1αsi RNA转染浓度下转染效率、细胞形态学改变及HIF-1αm RNA表达状况,确定最佳HIF-1αsi RNA转染浓度及序列。2.1倒置荧光显微镜:观察不同HIF-1αsi RNA转染浓度(20n M、50n M、80n M、100n M)下转染效率及细胞形态学改变确定最佳转染浓度(100n M)。2.2 Real-time PCR:检测使用不同HIF-1αsi RNA转染序列,转染食管鳞癌Eca-109细胞24h后HIF-1αm RNA表达情况,确定HIF-1αsi RNA最佳转染序列(HIF-1α-homo-1217)。结果1.化学性细胞缺氧模型的建立及HIF-1α在不同缺氧时间的表达1.1倒置显微镜下观察发现,食管癌Eca-109细胞在六孔板底部呈多形、铺路石样镶嵌分布,单层、贴壁生长,相互不重叠。在含150μmol/L Co Cl2培养液中培养,随着缺氧作用时间的延长,食管鳞癌Eca-109细胞逐步开始梭形化,部分细胞边缘变的不规则,细胞内部褐色颗粒增多,折光性下降,细胞碎片和悬浮死亡的细胞逐渐增多。缺氧0h(常氧)、3h、6h细胞死亡不明显,缺氧12h时有少量梭形细胞和悬浮死亡细胞出现,缺氧24h时梭形细胞和悬浮死亡细胞较缺氧12h显著增多,细胞生长状态较好;而缺氧48h时超过50%细胞死亡。为避免Co Cl2对诱导细胞缺氧损伤而引起的细胞凋亡对实验结果的影响,在后续的实验中,本次研究将选择Co Cl2作用24h作为缺氧组采样观察时间点。1.2 Real-time PCR结果显示:HIF-1αm RNA在食管鳞癌Eca-109细胞中缺氧0h(常氧)相对表达量为1±0.048。在缺氧3h、6h时相对表达量为0.732±0.102和0.613±0.114,较缺氧0h即常氧(1±0.048)有显著的下降(P<0.05);而缺氧12h、24h相对表达量分别为2.216±0.215、3.512±0.712,较缺氧0h(常氧)有显著的增高(P<0.05)。1.3 Western bloting结果显示:HIF-1α蛋白在食管鳞癌Eca-109细胞中缺氧3h、6h、12h、24h时其表达量分别为:1.692±0.166、1.802±0.131、1.804±0.094、2.099±0.095,较缺氧0h即常氧(0.631±0.086)有显著的增高(P<0.05)。2.使用HIF-1αsi RNA转染食管鳞癌Eca-109细胞阻断HIF-1α基因的表达2.1倒置荧光显微镜下观察发现,使用20n M Lipofectamine?2000和20n M带荧光标记HIF-1αsi RNA序列进行转染,发现视野中少量绿色荧光标记物质,被转染成功的绿色细胞数量非常低,肿瘤细胞生长良好,悬浮死亡细胞不明显;随着各实验组转染试剂浓度的增加,视野中绿色荧光标记物质增多,被转染成功的绿色细胞数量逐渐增多,其中以100n M Lipofectamine?2000和100n M HIF-1αsi RNA共转染组中被转染成功的绿色细胞数量最多,转染效率最高,且各实验组肿瘤细胞生长状态均良好,悬浮死亡细胞不明显。故选择使用100n M Lipofectamine?2000和100n M HIF-1αsi RNA进行转染。2.2 Real-time PCR结果显示:HIF-1αm RNA在空白对照组、HIF-1α-homo-NC组、HIF-1α-homo-934组、HIF-1α-homo-1067组和HIF-1α-homo-1217组相对表达量分别为:1±0.091、0.912±0.214、0.802±0.122、0.571±0.074、0.182±0.020。与空白对照相比HIF-1α-homo-NC组中HIF-1αm RNA的表达量无明显差别(P>0.05);而其余实验组均显著减少(P<0.05),其中,HIF-1α-homo-1217组HIF-1αm RNA的表达量最低。故选择HIF-1α-homo-1217组si RNA转染序列转染进行HIF-1α基因阻断。第二部分缺氧对食管鳞癌细胞IL-6、TGF-β1产生的影响研究方法1.缺氧时间对食管鳞癌Eca-109细胞IL-6、TGF-β1产生的影响1.1 Real-time PCR:检测IL-6、TGF-β1在不同缺氧时间0h(常氧)、3h、6h、12h、24h细胞内m RNA表达情况。1.2酶联免疫吸附法(Elisa):检测食管鳞癌Eca-109细胞在不同缺氧时间0h(常氧)、3h、6h、12h、24h上清液中IL-6、TGF-β1的浓度。2.HIF-1αsi RNA转染抑制HIF-1α活性对IL-6、TGF-β1产生的影响2.1 Real-time PCR:检测食管鳞癌Eca-109细胞常氧组(只加培养液)、缺氧组(含150μmol/L Co Cl2培养液)、HIF-1αsi RNA转染组(HIF-1αsi RNA)、双重作用组(150μmol/L Co Cl2+HIF-1αsi RNA)培养24h后,IL-6、TGF-β1的m RNA表达情况。2.2酶联免疫吸附法(Elisa):检测食管鳞癌Eca-109细胞常氧组、缺氧组、HIF-1αsi RNA转染组、双重作用组培养24h后培养基上清液中IL-6、TGF-β1的浓度。结果1.缺氧时间对食管鳞癌Eca-109细胞IL-6、TGF-β1产生的影响1.1 Real-time PCR结果显示:IL-6 m RNA缺氧3h、6h、12h、24h相对表达量分别为1.154±0.169、1.249±0.215、1.970±0.359、2.874±0.448,较缺氧0h(常氧)相对表达量(1±0.216)有显著的增高(P<0.05)。TGF-β1 m RNA在缺氧3h、6h、12h、24h相对表达量分别为1.286±0.210、1.637±0.147、1.913±0.578、2.557±0.194,较缺氧0h(常氧)相对表达量(1±0.024)有显著的增高(P<0.05)。1.2酶联免疫吸附法(Elisa)结果显示:IL-6在培养基上清液中活性蛋白分泌量在缺氧3h、6h为19.115±2.005、23.313±1.820(pg/ml),较缺氧0h(常氧)分泌量(30.201±2.197pg/ml)显著下降(P<0.05);而缺氧12h、24h时的分泌量为31.434±10.558、43.403±7.824(pg/ml),较缺氧0h(常氧)显著增高(P<0.05)。TGF-β1的活性蛋白分泌量在缺氧0h(常氧)、缺氧3h、6h、12h分别为80.424±9.228、75.412±0.305、84.251±7.014、74.539±23.117(pg/ml);而缺氧24h时分泌量为207.551±9.154 pg/ml,较缺氧0h(常氧)有显著的增高(P<0.05)。2.转染HIF-1αsi RNA抑制HIF-1α活性可减少IL-6、TGF-β1的产生2.1 Real-time PCR结果显示:IL-6 m RNA的相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(0.314±0.147)、双重作用组(0.847±0.162)显著低于常氧组(1±0.126)、缺氧组(1.601±0.296)中的表达(P<0.05);且HIF-1αsi RNA转染组中IL-6m RNA的相对表达量显著低于双重作用组(P<0.05)。TGF-β1的相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(0.198±0.052)、双重作用组(0.522±0.294)显著低于常氧组(1±0.208)、缺氧组(3.122±0.317)中的表达(P<0.05);且HIF-1αsi RNA转染组中TGF-β1 m RNA的相对表达量显著低于双重作用组(P<0.05)。2.2酶联免疫吸附法(Elisa)结果显示:IL-6活性蛋白在食管鳞癌Eca-109细胞培养基上清液中的分泌量在HIF-1αsi RNA转染组(15.543±2.143 pg/ml)显著低于常氧组(27.796±1.896 pg/ml)、缺氧组(43.002±3.518pg/ml)和双重作用组(29.042±1.257 pg/ml)(P<0.05),且HIF-1αsi RNA转染组中IL-6蛋白分泌量显著低于双重作用组(P<0.05)。TGF-β1活性蛋白在食管鳞癌Eca-109细胞培养基上清液中的分泌量在HIF-1αsi RNA转染组(86.737±15.457 pg/ml)显著低于常氧组(171.757±24.773pg/ml)、缺氧组(230.293±2.677 pg/ml)、双重作用组(153.667±35.704pg/ml)(P<0.05),且HIF-1αsi RNA转染组中TGF-β1蛋白分泌量显著低于双重作用组(P<0.05)。第三部分缺氧在食管鳞癌细胞上皮间质转化中的作用研究方法1.转染HIF-1αsi RNA后食管鳞癌Eca-109细胞形态学变化倒置显微镜:检测食管鳞癌Eca-109细胞在常氧组(只加培养液)、缺氧组(含150μmol/L Co Cl2培养液)、HIF-1αsi RNA转染组(HIF-1αsi RNA)、双重作用组(150μmol/L Co Cl2+HIF-1αsi RNA)培养24h后,细胞形态学变化。2.转染HIF-1αsi RNA对各组细胞HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表达的影响2.1 Real-time PCR:检测食管鳞癌Eca-109细胞常氧组、缺氧组、HIF-1αsi RNA转染组、双重作用组培养24h后,HIF-1α、E-cadherin、Vimentin的m RNA表达情况。2.2 Western bloting:检测食管鳞癌Eca-109细胞在常氧组、缺氧组、HIF-1αsi RNA转染组、双重作用组培养24h后,HIF-1α、E-cadherin、Vimentin的细胞内蛋白表达情况。3.转染HIF-1αsi RNA对食管鳞癌Eca-109细胞迁移、侵袭能力的影响3.1 Transwell体外迁移实验:检测HIF-1αsi RNA转染24h后食管鳞癌Eca-109细胞体外迁移运动能力的变化。3.2 Transwell体外侵袭实验:检测HIF-1αsi RNA转染24h后食管鳞癌Eca-109细胞体外侵袭能力的变化。结果1.转染HIF-1αsi RNA后食管鳞癌Eca-109细胞形态学变化倒置显微镜下观察发现:食管癌Eca-109细胞在六孔板底部呈多形、铺路石样镶嵌分布,单层、贴壁生长,相互不重叠。与缺氧组相比,常氧组、HIF-1αsi RNA转染组及双重作用组中细胞间隙少,细胞排列较为紧密,梭形细胞和悬浮死亡细胞的数量相对较少;HIF-1αsi RNA转染组中长梭形细胞数量最少。2.转染HIF-1αsi RNA抑制HIF-1α活性,可部分抑制食管鳞癌Eca-109细胞的EMT转化2.1 Real-time PCR结果显示:HIF-1αm RNA的相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(0.148±0.087)、双重作用组(0.252±0.091),显著低于常氧组(1±0.011)、缺氧组(2.417±0.104)(P<0.05),并且HIF-1αsi RNA转染组HIF-1αm RNA的相对表达量显著低于双重作用组(P<0.05)。E-cadherin m RNA的相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(1.711±0.357)、双重作用组(1.221±0.129),显著高于常氧组(1±0.126)、缺氧组(0.201±0.226)(P<0.05),并且HIF-1αsi RNA转染组E-cadherin m RNA相对表达量显著高于双重作用组(P<0.05)。Vimentin m RNA相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(0.617±0.076),显著低于常氧组(1±0.241)、缺氧组(2.283±0.348)和双重作用组(1.247±0.196)(P<0.05)。2.2 Western bloting结果表明:HIF-1α蛋白的相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(0.343±0.019)、双重作用组(0.420±0.021),显著低于常氧组(1.121±0.094)、缺氧组(1.553±0.135)(P<0.05),并且HIF-1αsi RNA转染组细胞内HIF-1α蛋白的相对表达量显著低于双重作用组(P<0.05)。E-cadherin蛋白的相对表达量在HIF-1αsi RNA转染组(3.971±0.097)、双重作用组(3.673±0.017),显著高于常氧组(3.270±0.020)、缺氧组(1.978±0.035)(P<0.05),并且HIF-1αsi RNA转染组E-cadherin蛋白的相对表达量显著高于双重作用组(P<0.05)。Vimentin蛋白相对表达量在在HIF-1αsi RNA转染组(1.849±0.155)、双重作用组(2.163±0.183),显著低于常氧组(2.506±0.132)、缺氧组(4.376±0.097)(P<0.05),并且HIF-1αsi RNA转染组Vimentin蛋白的相对表达量显著低于双重作用组(P<0.05)。3.转染HIF-1αsi RNA抑制HIF-1α基因的表达能够降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力3.1 Transwell体外迁移实验结果显示:细胞穿膜数缺氧组(475.33±21.54)最多,常氧组细胞的穿膜数(312.18±12.32)次之,HIF-1αsi RNA转染组(157.28±15.68)和双重作用组(202.37±15.26)的细胞穿膜数显著降低(P<0.05),HIF-1αsi RNA转染组细胞穿膜数最少,说明转染HIF-1αsi RNA之后,在一定程度上抑制了食管癌Eca-109细胞的体外迁移能力。3.2 Transwell体外侵袭实验结果显示:细胞穿膜数缺氧组(143.28±11.52)最多,常氧组细胞的穿膜数(85.43±8.03)次之,HIF-1αsi RNA转染组(36.16±10.34)与双重作用组(69.34±10.50)显著减少(P<0.05),且HIF-1αsi RNA转染组细胞穿膜数最少。说明转染HIF-1αsi RNA之后,食管癌Eca-109细胞的体外侵袭能力受到了抑制。结论1.缺氧可诱导食管鳞癌Eca-109细胞中IL-6、TGF-β1的m RNA表达和蛋白分泌增加。2.缺氧可诱导食管鳞癌细胞发生EMT,并增强食管鳞癌Eca-109细胞的体外迁移力和侵袭能力。3.缺氧诱导的食管鳞癌细胞EMT可能与产生和分泌更多的TGF-β1及IL-6相关。转染HIF-1αsi RNA可部分阻断IL-6、TGF-β1的表达,在一定程度上抑制了食管鳞癌细胞EMT的发生,并降低其体外迁移力和侵袭能力。