【摘 要】
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研究目的:杯状细胞是肠道负责分泌黏蛋白和形成肠黏膜层的主要细胞,肠黏膜是抵御肠腔内物理和化学刺激损伤的第一道防线。杯状细胞和黏膜层的缺失或功能障碍与肠道感染、炎症性肠病、囊肿性纤维化和粘液性腺癌发生密切相关。其中,微生物、肠黏膜、肠道上皮细胞和肠道免疫系统的相互调控是维持肠道内环境平衡的最重要的因素。然而目前缺乏可供研究它们之间相互作用关系的体外模型。肠黏膜屏障的破坏是多种肠道疾病共同的病理学基础
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研究目的:杯状细胞是肠道负责分泌黏蛋白和形成肠黏膜层的主要细胞,肠黏膜是抵御肠腔内物理和化学刺激损伤的第一道防线。杯状细胞和黏膜层的缺失或功能障碍与肠道感染、炎症性肠病、囊肿性纤维化和粘液性腺癌发生密切相关。其中,微生物、肠黏膜、肠道上皮细胞和肠道免疫系统的相互调控是维持肠道内环境平衡的最重要的因素。然而目前缺乏可供研究它们之间相互作用关系的体外模型。肠黏膜屏障的破坏是多种肠道疾病共同的病理学基础,通过移植杯状细胞修复肠道黏膜层将是治疗各种肠道疾病的新策略。本研究拟通过化学法诱导获得杯状细胞,通过杯状细胞体外构建黏膜-微生物的相互作用研究模型,并评估移植杯状细胞治疗肠炎的潜能。方法:基于对肠道杯状细胞发育过程调控机理的理解,筛选小分子化合物和蛋白因子诱导人表皮干细胞向杯状细胞定向重编程。通过细胞形态、免疫荧光染色、PAS染色、Alcian Blue染色、投射电子显微镜观察超微结构、基因表达和分泌黏液功能等多方面鉴定诱导的杯状细胞。进一步评估诱导的杯状细胞对促黏液分泌素CCh、LPS、PSCK、IL-13等刺激的反应,通过PAS定量分析黏蛋白分泌水平变化和RT-q PCR分析黏液相关基因表达改变情况。体外分析诱导的杯状细胞是否能够摄取和传递荧光抗原。利用肠道侵袭性大肠埃希菌和致病性大肠埃希菌粘附实验去验证细菌对诱导的杯状细胞的粘附性。通过Transwell非直接共培养系统将微生物和诱导的杯状细胞非直接共培养,自发形成胶样黏膜层,构建黏膜-微生物相互作用的研究模型。通过肠道直接移植诱导的杯状细胞到DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠,评估其保护肠黏膜和肠道上皮,促进结肠炎恢复的潜能。结果:化学法诱导人表皮干细胞直接重编程为杯状细胞,具有类似于杯状细胞的形态特征,投射电子显微镜显示细胞内储存大量黏液颗粒,免疫荧光显示诱导的细胞表达杯状细胞标志物MUC2以及一些上皮细胞标志物。PAS染色和Alcian Blue染色显示诱导的细胞分泌中性和酸性黏蛋白。RT-q PCR定量分析表示黏蛋白基因（MUC2）以及黏液相关基因（RELMβ、FCGBP、ZG16、AGR2和TFF3）以及杯状细胞发育和分化相关基因（ATOH1和SPDEF）显著上调。这些结果共同证明诱导的细胞是杯状细胞。诱导的杯状细胞还能够摄取和传递荧光抗原罗丹明-葡聚糖。大肠埃希菌能够粘附在杯状细胞上,引起杯状细胞的损伤。微生物和诱导的杯状细胞非直接共培养能够诱发杯状细胞分泌黏蛋白和形成胶样的黏膜层,其中定植了大量的细菌,模拟了体内肠道黏膜层状态。移植诱导的杯状细胞能够保护肠黏膜和促进结肠炎的功能恢复。结论:成功建立了化学法诱导人表皮干细胞直接重编程为杯状细胞,诱导的杯状细胞能够分泌黏蛋白和传递抗原。微生物和杯状细胞非直接共培养能够形成胶样黏膜层,用于模拟肠道黏膜和微生物相互作用关系。移植杯状细胞能够减轻结肠炎模型的症状。因此,化学法诱导的杯状细胞可用于研究杯状细胞发育和分化机制,构建的胶样黏膜层将为研究杯状细胞、微生物和肠黏膜相互作用关系提供了体外模型,为抗菌药物筛选提供了体外平台。此模型还可以用于研究促进肠黏膜修复和重建新的方法,为肠道疾病治疗找到新的治疗方法。移植诱导的杯状细胞将能促进肠道黏膜的修复,保护肠道上皮细胞避免进一步受损,有望治疗多种肠道疾病。
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