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开发新的化合物以提高甾体药物的选择性和减少副作用一直是一个挑战,引起了医药化学家的广泛关注。大多数化疗药物通过凋亡信号通路诱导肿瘤细胞死亡,通常会产生耐药性,引发坏死性凋亡在癌症治疗中的研究就变得尤为重要,因为坏死性凋亡可以避开细胞阻滞或逃逸产生的凋亡抗性从而杀死癌细胞。我们课题组前期对孕烯醇酮C-17位进行结构修饰,引入了含氮杂环,本论文对合成的衍生物通过初步在线活性评估及体外抗肿瘤活性筛选后,挑选出高生物活性化合物2j作为目标化合物,探究对PC-3细胞的抗癌作用机理。具体研究内容如下:1.利用在线软件评估衍生物的类药性和生物活性、潜在毒性及相关药代动力学参数,结果显示合成的衍生物多数都符合“五原则”中的三个原则,少数符合其中四个原则,并且多数化合物都具有较好的生物活性,尤其是对酶的抑制能力,得分最高,安全性良好,无潜在毒性,大多数具有较好的吸收特性,与血浆蛋白的结合率较高,对血脑屏障几乎无渗透作用。利用MTT实验,对衍生物进行初步的体外抗癌活性筛选,结果显示衍生物对所选癌细胞具有一定的细胞毒性,且具有选择性,尤其是对前列腺癌具有较强的抗增殖能力。结合以上参数,我们最终选定2j进行下一步研究。2.采用MTT和克隆形成法检测2j对PC-3的增殖抑制作用,结果显示2j以时间和浓度依赖方式抑制PC-3细胞增殖,也可抑制克隆的形成。使用细胞周期检测试剂盒检测2j对PC-3周期进程的影响,结果显示2j可诱导PC-3细胞阻滞于G0/G1期。通过流式细胞术检测2j对PC-3 Annexin V-FITC和PI双染的影响,结果显示2j可诱导PC-3晚期凋亡/坏死。接下来,又采用MTT及流式双染实验,检测加入caspase抑制剂和坏死性凋亡抑制剂后2j对PC-3存活能力的影响,结果显示2j诱导的PC-3细胞死亡是非caspase依赖性的,部分可以被Nec-1抑制剂所阻断。膜破裂是坏死性凋亡的典型形态学特征,因此我们又采用台盼蓝染色及LDH释放实验检测2j对膜完整性丧失的影响和质膜破裂时LDH的活性,结果显示部分细胞被染色,2j可破坏细胞膜的完整性,并使LDH释放增加,且Nec-1可以逆转LDH的释放。最后,我们又运用Western blotting实验检测与坏死性凋亡相关的蛋白表达情况,结果显示2j可诱导坏死性凋亡关键蛋白上调。3.采用划痕、Transwell法检测2j对PC-3迁移能力的影响,并采用Western blotting实验检测EMT相关蛋白的表达情况,结果显示2j可抑制PC-3细胞体外迁移,并降低N-cadherin、Vimentin的表达量,增加E-cadherin的表达量。4.采用ATP检测试剂盒检测2j对PC-3细胞内ATP含量的影响,结果显示2j可降低细胞内ATP的含量。加入活性氧清除剂NAC,检测NAC对抗肿瘤逆转的影响,结果发现NAC可减弱2j的细胞毒作用。使用活性氧检测试剂盒检测2j对PC-3细胞内ROS水平的影响,结果发现2j可浓度依赖使细胞内ROS水平升高,12 h后又下降。采用Western blotting实验检测2j与NAC联用对坏死性凋亡关键蛋白表达情况,我们发现联用后可减少坏死性凋亡通路关键蛋白分子P-RIP1/3、P-MLKL 的表达。综上所述,本论文对合成的孕烯醇酮C-17位吡啶取代系列衍生物进行相关参数评估和体外抗癌活性检测后,选出2j为目标化合物,确定了 2j可抑制PC-3细胞增殖,抑制其体外迁移,诱导细胞坏死性凋亡,且主要经由RIP1/RIP3/MLKL信号通路,另外也可能与活性氧的产生有关。本研究为开发新型甾体类抗肿瘤药物提供了实验依据并奠定了理论基础。