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蜱是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。蜱的唾液腺在吸血过程中具有关键作用,也是蜱传播病原的主要器官。蜱的唾液腺在饱血后会经历快速的退化,以适应后续蜕皮发育或生殖产卵的生理学需要,但其调控机制不明。本论文以镰形扇头蜱为研究对象,聚焦蜱吸血后唾液腺退化这一生物学现象,从唾液腺退化过程中细胞自噬和凋亡的联络机制上展开研究,以期在分子水平上解析蜱的退化机制,为蜱的新型控制技术提供理论基础。主要研究结果如下:一、蜱唾液腺退化过程中的细胞自噬和细胞凋亡的动态检测和转录组分析通过透射电镜（TEM）和TUNEL染色结果显示在整个蜱的吸血期和饱血后均可观察到双层膜包裹的自噬体,细胞自噬无显著变化;但进入快速吸血期和饱血后蜱的唾液腺TUNEL染色阳性率显著升高,表明蜱的唾液腺退化以细胞凋亡为主。根据上述结果,选择未吸血及饱血后唾液腺进行转录组差异分析筛选关键基因,结果表明大部分细胞自噬相关基因的转录水平无显著变化,而大部分细胞凋亡相关基因的转录水平饱血后显著上升,与饱血后蜱唾液腺细胞凋亡水平显著升高基本一致。二、蜱唾液腺退化中重要的细胞自噬和凋亡分子的基因克隆、序列分析和重组表达根据不同吸血时间唾液腺转录组的分析结果,我们选择其中两个自噬相关（ATG）分子和三个细胞凋亡相关胱天蛋白酶（Caspase）分子开展进一步研究,分别克隆其编码基因。根据序列比对结果,两个ATG分子命名为RhATG5和RhATG6。三个细胞凋亡相关Caspase分子,命名为RhCaspases-7、-8、-9,均具有胱天蛋白酶的保守序列特征。经原核表达获得重组蛋白用于制备多克隆抗体,后续研究奠定了基础。三、RhCaspase-7、-8、-9之间的相互作用及其在蜱唾液腺退化中的作用机制RT-qPCR分析证实,RhCaspase-7、-8、-9的转录水平在每个发育阶段的饱血阶段（饱血幼蜱、饱血若蜱和饱血成蜱）显著升高。饱血后唾液腺中RhCaspases-7、-8、-9的转录水平比其他组织增加也更加显著。RNA干扰RhCaspase-9可显著抑制蜱的吸血,而干扰RhCaspase-7、-8后对蜱的吸血并无影响;与对照组相比,干扰RhCaspase-7、-8和-9后,凋亡水平显著降低。共转染实验表明RhCaspase-7可被RhCaspase-8和RhCaspase-9剪切,表明了RhCaspase-7为效应Caspase分子,而RhCaspase-8和RhCaspase-9为启始Caspase分子。四、RhATG5调控蜱唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化通过western blot检测发现RhATG5在蜱的吸血前期表达量低,后期表达量升高,与凋亡标志分子一致。同时RhATG5在蜱的吸血后期发生剪切。His-RhATG5与μ-Calpain共孵育,结果显示RhATG5在Ca2+存在的条件下可被μ-Calpain剪切。体外培养的蜱的唾液腺组织中加入不同浓度的20E,高浓度的20E处理后,导致蜱唾液腺中的Ca2+浓度和RhCalpains的转录水平表达量升高,RhATG5裂解为NtRhATG5,自噬标志分子降低而凋亡标志分子表达量升高,促进了细胞自噬向细胞凋亡转化。RhATG5的体外RNAi结果显示,唾液腺中的细胞自噬和细胞凋亡均被抑制,证明RhATG5对蜱的细胞自噬和细胞凋亡均有调节作用。上述结果表明,高浓度的20E可通过升高细胞内Ca2+的浓度导致RhATG5的剪切,并引起细胞自噬向细胞凋亡的转化,加快唾液腺的退化进程。五、宿主Beclin-1分子调控唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化通过免疫荧光检测,发现宿主来源的Beclin-1出现在蜱唾液腺退化过程中,且其出现在蜱血淋巴中的时间（吸血第5-7天）要早于蜱唾液腺中（饱血后1-2天）时间。蜱显微注射homo-Beclin-1重组蛋白可引起唾液腺的自噬和凋亡相关分子转录水平和TUNEL染色阳性率的显著升高,与注射20E效果一致。同时注射Beclin-1和20E后,蜱的唾液腺退化进程加快,而当加注自噬和凋亡抑制剂后,自噬和凋亡相关因子转录水平明显降低。Beclin-1被Caspase酶降解是Beclin-1促凋亡作用的机制之一,western blot检测结果表明在快速吸血期蜱唾液腺中宿主来源的Beclin-1发生了剪切。体外共转染实验结果显示,homo-Beclin-1可被三个RhCaspase剪切,而切割位点突变后的homo-Beclin-1不会被剪切。Co-IP结果发现homo-Beclin-1可与RhBCL-2结合形成免疫共沉淀,使RhBCL-2的BH3结构域被封闭,RhBCL-2抗凋亡作用消失,加速细胞凋亡发生。综上所述,本研究表明蜱唾液腺的退化是以细胞凋亡为主,细胞自噬参与的细胞程序化死亡的过程。快速吸血期,血淋巴中蜕皮激素浓度升高,Ca2+浓度升高,导致自噬分子ATG5发生剪切,细胞自噬转化为细胞凋亡;另一方面,宿主Beclin-1分子在唾液腺内发生累积,可被蜱源的Caspase剪切,或通过与蜱源BCL-2的结合,进一步促进细胞自噬向细胞凋亡转化,加快唾液腺的退化进程。因此,蜱唾液腺退化过程中,蜱自噬分子ATG5和宿主来源的Beclin-1发挥了细胞自噬和凋亡之间的分子联络作用。