纤维素酶的计算分析和根癌农杆菌介导转化米曲霉方法的初步建立

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纤维素酶的研究是目前一个广受关注的热点。寻求更高效能的纤维素酶是目前纤维素酶产业发展的主要趋势。通过基因工程技术,来提高纤维素酶的热稳定性和pH的适应范围,有利于纤维素酶的工业应用。   本研究通过氨基酸成分计算分析,指出了与水解糖苷酶第45家族酶系最适作用温度和pH有较大相关性的单个氨基酸和氨基酸对,并在这一基础上引入21种天然氨基酸的热稳定常量进行计算,进一步分析发现,与水解糖苷酶第45家族酶系的最适作用温度有显著相关的氨基酸对为:AE、FK和AI。与水解糖苷酶第45家族酶系的最适作用pH呈正相关的单个氨基酸和氨基酸对为:A、W、I和E;WA和SS,呈负相关的单个氨基酸和氨基酸对为:S;LY、PT、KR和MN。这些直接建立在氨基酸含量分析基础上的高显著性结果,对水解糖苷酶第45家族酶系纤维素酶的基因工程改造可以提供一定价值的理论支持。   根癌农杆菌介导转化丝状真菌有着转化效率高、可导入大片段的DNA、导入基因表达效果好,稳定遗传等优点。因此,针对米曲霉建立根癌农杆菌介导转化的方法,无论是对于外源蛋白在米曲霉中表达,还是米曲霉功能基因组的研究都将提供十分有效的手段。   本研究首先构建针对营养缺陷型宿主米曲霉niaD300的根癌农杆菌介导转化双元载体-pBI-niad,并通过共培养发现了米曲霉niaD300和农杆菌代谢互补的现象,从而证明了利用营养缺陷型宿主作为农杆菌介导转化研究的筛选标记的不可行。然后,通过抗生素测定,确定了Pyrithiamine为农杆菌介导转化米曲霉实验的抗生素,浓度为:0.1μg/ml。利用Gateway技术构建双元载体pHGW-ptr。最后,利用农杆菌成功的介导转化了米曲霉RIB40和niaD300,并通过米曲霉菌丝PCR验证转化子,确定了转化的成功,转化效率为:1~3个转化子/106个孢子。
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