利用RNAi技术构建水稻酚酸合成途径关键基因OsPAL干涉材料

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植物次生代谢物质是连接植物之间以及植物与微生物之间关系的纽带与桥梁。目前从水稻各器官中分离得到了多种具有抗草抗病活性的物质,主要为酚酸类、萜烯类和黄酮类物质。由于酚酸在植物体内的大量存在以及对植物生长的影响,长期以来一直被认为是水稻的主要化感物质。但也有学者持不同意见,研究表明水稻土壤中酚酸类物质的浓度达不到具有生理毒害的水平,不能很好地解释水稻的化感作用,酚酸类物质的含量和种类在不同的水稻品种之间并没有显著差异。另有研究表明,萜烯类物质稻壳酮(momilactones)既是水稻的植保素,又是水稻的主要化感物质。这些研究结果对酚酸是否是水稻的主要化感物质提出了质疑。植物受到病原菌侵染时,能直接或间接诱导体内一系列防御反应的信号转导途径关键酶基因的表达,启动相关的防御信号转导途径,激活植物自身防御系统以保护自己。RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术作为一项新的生物学技术,能通过基因转录后的调控,抑制特定基因的表达,此方法的优点在于只改变目的基因,而不改变植物本身的遗传背景。本研究利用RNAi技术使酚酸类物质生物合成途径和水杨酸(SA)信号途径的关键调控基因OsPAL发生沉默,分析水稻化感作用的功能性状与OsPAL基因功能之间的相关性,以阐明水稻化感作用的关键物质与分子调控机理。 本研究首先提取水稻RNA,然后反转录得到cDNA,同时设计引物获得OsPAL目的片段,并提取载体质粒DNA。将目的基因片段和质粒通过两轮装载,构建RNA干涉载体并转化到农杆菌中去,再通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织,通过对T0代OsPAL转化植株进行PCR检测,分析目的基因OsPAL在转化植株中的表达情况以及干涉效果,并收获转基因种子,为后续的研究提供OsPAL基因沉默的转基因水稻材料。 本研究获得的主要结果包括:成功构建OsPAL基因的RNAi载体,并证明该载体在农杆菌中能稳定表达;通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织,得到了OsPAL干涉后的转基因植株,并收获部分种子;利用离体叶片潮霉素快速鉴定、PCR扩增HPT基因和实时荧光定量PCR法(Real-Time PCR)对转基因植株进行鉴定,证实了OsPAL基因片段正确插入到水稻基因组中,利用Real-Time PCR对部分转基因植株目的基因片段的mRNA表达量进行分析,结果表明大部分植株OsPAL基因表达产物mRNA被降低,说明OsPAL,基因的RNAi干涉水稻已经获得。本研究获得的RNA干涉水稻材料为进一步研究OsPAL基因的功能和确定酚酸类物质是否是水稻化感作用的关键物质提供研究材料和奠定基础。
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