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背景及目的：癫痫(Epilepsy, EP)是一种常见病,多发病。据流行病学调查,人群患病率为5‰～6‰,严重危害人类健康,影响人们生活质量,致残、致死率较高。癫痫持续状态是癫痫连续发作之间意识尚未完全恢复又频繁再发,或癫痫发作持续30分钟以上不自行停止。癫痫持续状态(Status Epilepy, SE)是内科常见急症,若不及时治疗可因神经元损伤导致永久性脑损害。大量癫痫持续状态动物模型的研究均已证实,癫痫持续状态可使海马神经元产生氧化应激损伤及神经元凋亡。脑组织神经元不断产生活性氧产物,如NO、过氧化氢及超氧化物,同时脑组织中存在包括SOD在内的多种抗氧化物,两者之间维持着微妙的平衡以保护脑组织免受活性氧产物的损伤。当活性氧产物迅速增加,这种平衡被打破,便会对脑组织产生氧化损伤。由于脑组织耗氧量大,产生的活性氧产物多,使得脑组织容易发生氧化应激损伤。越来越多的数据表明,氧化应激损伤在多种神经科疾病如脑缺血和癫痫中都发挥着重要作用。FK506是一种高效免疫抑制剂,目前临床上广泛用于控制器官移植后的排斥反应,它可通过与FK506结合蛋白12(FKBP12)相结合,抑制CaN的活性来发挥生物学作用。近年来研究发现,FK506尚具有免疫抑制作用以外的神经营养和神经保护作用。Furuichi等在大鼠脑缺血模型中发现FK506有神经保护作用,不仅可缩小梗死面积,还能减轻因神经细胞凋亡所致的功能丧失。在海人酸诱导的癫痫模型中,FK506可阻止芽孢再生而具有神经保护作用。尽管FK506在缺血和癫痫动物实验模型中有保护作用,但其具体作用机制仍不十分清楚。本研究应用匹鲁卡品建立大鼠癫痫持续状态模型,观察海马组织氧化应激反应相关指标(NO, NOS, MDA, SOD)的变化及Active Caspase-3蛋白的表达；研究FK506对上述指标的影响,探讨FK506抗癫痫及其脑保护作用的可能机制。方法：(1)利用腹腔注射给药的方法建立匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫持续状态模型。随机将健康Wistar大鼠分为正常对照组(Control组)54只,癫痫模型组(Pilo组)54只,FK506预防组(FK506组)54只和生理盐水预防组(Saline+Pilo组)54只。FK506预防组在造模前24小时及1小时共两次应用FK506。生理盐水组在造模前24小时及1小时共两次应用生理盐水。每组6只于SE终止后6h(SE6h)进行心脏灌注,6只于SE终止后7d (SE7d)进行心脏灌注,行免疫组化检测及光镜HE染色。其余42只分为七组,分别于SE终止后0.5h (SEO.5h)、2h (SE2h)、6h (SE6h)、12h (SE12h)、Id (SEld)、3d (SE3d)、7d (SE7d)处死,分离新鲜海马组织,-80度保存,行NO、NOS、MDA、SOD及Active Caspase-3含量检测。(2)根据Racine分级观察大鼠癫痫发作行为变化,记录癫痫发作潜伏期、发作程度。(3)光镜HE染色观察各组大鼠癫痫发作后6h及7d海马神经元的形态及数目改变并观察FK506的作用。(4)应用试剂盒检测海马组织NO含量,NOS活性,MDA含量及SOD活性的变化。NOS有三种不同的亚型,为神经元型(nNOS),内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS),前两种合称为结构型NOS,即cNOS,由于无法直接检测nNOS的活性,国外报道通过免疫印迹法证实癫痫时nNOS是cNOS活性增加的主要因素[23],因此我们在本次试验中通过检测cNOS的活性来间接反应nNOS的活性。(5)应用免疫组化法观察致痫后6h大鼠海马神经元型NOS (nNOS),7d诱导型NOS (iNOS),7d神经元Active Caspase-3表达的变化。(6)应用Western Blot法检测不同时间点(2h、6h、3d、7d) nNOS、iNOS、Active Caspase-3表达的变化。(7)各项计数指标应用Spss13.0统计软件进行相关统计学分析。结果：1、FK506抑制癫痫发作：癫痫Pilo组、FK506组、Saline+Pilo组大鼠在注射匹鲁卡品后均出现癫痫发作,开始发作程度较轻,逐渐加重,直至癫痫持续状态。但是潜伏期和发作强度有所不同。FK506组大鼠的潜伏期延长(P<0.05),且发作强度级别降低(P<0.05)。Pilo组与Saline+Pilo组之间潜伏期和发作强度无明显差异。Control组大鼠无癫痫发作。2、FK506减轻癫痫后脑细胞神经元损伤：在光镜下,SE后6h Control组大鼠海马未见损害性改变,CA3区锥体神经元排列整齐紧密,胞浆透明,细胞核呈圆形或椭圆形,染色质分布均匀,核仁清晰,形态正常；Pilo组大鼠的海马神经元不同程度变性坏死,数目减少(P<0.05),排列散乱,变性神经元胞体肿胀变形,坏死的神经元胞浆皱缩,红染,核碎裂甚至消失；FK506组神经元数目较Control组也有减少,但较Pilo组存活神经元明显增多(P<0.05)。SE后7d Pilo组海马神经元变性坏死更加严重,应用FK506后海马损伤明显减轻(P<0.05)。3、FK506抑制NO含量升高：Pilo组大鼠在SE后0.5h海马组织中NO的含量即升高,6h出现第一个高峰(P<0.01),随后降低,在3d、7d时再次出现升高,至7d时达到第二个高峰(P<0.01)。与Pilo组相比,FK506组在6h和7d两个时间点时NO含量明显下降(P<0.05)。4、FK506抑制NOS活性升高：Pilo组大鼠cNOS的活性在SE后出现升高,6h达高峰(P<0.01),随后出现下降。而iNOS的活性则是缓慢升高,在7d时达到高峰(P<0.01)。FK506组大鼠6h时cNOS活性及7d时iNOS活性与Pilo组大鼠相比明显降低(P<0.05)。5、FK506抑制MDA升高：SE后Pilo组大鼠海马组织中MDA的含量出现升高,一直持续到SE后7d(P<0.01)。与Pilo组大鼠相比,FK506组大鼠7d时MDA含量明显降低(P<0.05)。6、FK506促使SOD活性升高：Pilo组大鼠SOD的活性在2h时明显高于Control组(P<0.01),在24h时降至正常水平(P>0.05),7d时再次出现升高(P<0.05)。与Pilo组相比,FK506组大鼠SOD活性在2h、7d明显升高(P<0.05)。7、FK506抑制NOS和Active Caspase-3阳性细胞表达：免疫组织化学检测发现,Pilo组大鼠nNOS阳性细胞在SE6h时明显表达,iNOS和ActiveCaspase-3阳性细胞在SE7d明显表达。应用FK506后,阳性细胞表达明显减少。8、FK506抑制NOS和Active Caspase-3蛋白表达增加：Western Blot检测发现,Pilo组nNOS的含量在SE后出现升高,6h达到高峰(P<0.01). iNOS在SE后6h开始升高,7d时达到高峰(P<0.01); Active Caspase-3的含量在3d时出现升高,7d时达到高峰(P<0.01)。应用FK506后,6h时nNOS的含量(P<0.05)、7d时iNOS(P<0.05)和Active Caspase-3(P<0.05)的表达均明显下降。结论：1、SE后NO介导的氧化应激具有双重的神经毒性作用,早期可能通过各种途径损害线粒体功能,晚期可激活神经元凋亡途径。2、在匹鲁卡品诱导的癫痫持续状态模型中,氧化应激引起的神经元损伤要早于Caspase-3的激活,此可能有助于对SE后早期神经元损伤相关机制的进一步研究,同时提示抗氧化可作为SE后神经保护的干预措施之一3、FK506在SE发作后早期抑制氧损伤,减轻氧化应激反应；同时可能通过对晚期iNOS的抑制降低后期的氧化应激反应、抑制Caspase-3凋亡途径,发挥神经保护作用。此研究可能为FK506将来的神经科临床应用提供一定的理论基础。