【摘 要】
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目的:研究正常豚鼠心脏Na,K-ATPase α亚型的表达情况.方法:采用RNase保护分析法(RNase protection assay)检测Na,K-ATPase α亚型的表达.(1)合成α 1、α 2、α 3亚型特异性
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目的:研究正常豚鼠心脏Na,K-ATPase α亚型的表达情况.方法:采用RNase保护分析法(RNase protection assay)检测Na,K-ATPase α亚型的表达.(1)合成α 1、α 2、α 3亚型特异性的放射性同位素标记的cRNA探针:首先从豚鼠脑组织提取RNA进行反转录,以其cDNA链作为PCR扩增的模板,用各亚型特异的引物扩增出cDNA双链,扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将长度相符的条带在紫外灯下切下并纯化回收;随后将回收的DNA片段与pGEM-T载体连接并转化到DH5 α感受态细胞中,鉴定插入方向;选择正向插入的重组子提取质粒,经适当的限制性内切酶线性化重组质粒后利用T7 RNA聚合酶转录出各亚型特异性的放射性标记的cRNA探针.(2)分别用过量的cRNA探针与从靶组织提取的RNA杂交,并用RNase消化杂交体,由于RNase对单链专一,双链则受到保护未被消化.另外,杂交体系还包括GAPDH的探针,以此来证实反应过程中样品未丢失.(3)通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离杂交双链,对干燥的凝胶进行放射自显影.结论:正常豚鼠心脏只表达Na,K-ATPase α 1和α 2亚型,不表达α 3亚型.而豚鼠脑组织均表达α 1、α 2和α 3亚型.
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