里氏木霉内切葡萄糖苷酶EGI在毕赤酵母中的克隆表达和优化

来源 :南京工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:JK0803Tangxu
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的可再生资源。目前,自然界中纤维素只有一小部分得到了利用,绝大多数纤维素不仅被白白浪费,而且对环境造成了污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。将里氏木霉纤维素酶内切葡萄糖苷酶基因,用基因工程方法高效分泌表达,并研究其酶学性质,为改进酶学活性提供研究参数,奠定基础。   目前纤维素的研究已经日趋成熟,但对于里氏木霉内切葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质的研究甚少。本文成功的克隆了里氏木霉内切葡萄糖苷酶EGI基因,将其连接到pPIC9K载体,构建了分泌表达型毕赤酵母质粒pPIC9K-egl,并把它整合到了毕赤酵母基因组中,利用甲醇对阳性转化子进行了较为系统的诱导表达条件优化,确立了最佳表达条件为:30℃下,诱导剂浓度为2%,接种量为OD6002.5,氮源为1.0%的蛋白胨,摇床转速为200rpm,起始培养基PH为6.0时酶的活性最高,最大酶活出现在甲醇诱导表达48 h-60h之间。   在摇瓶优化条件的基础上,对毕赤酵母重组子GS115/egl进行了5L发酵罐的高密度培养。将发酵上清超滤浓缩后,采用离子交换的方法进行分离纯化,制备纯酶,并测定其活性和酶学性质。纯化后的酶活性为0.892U/mL,比酶活为11.952U/mg,比未纯化前提高了1.82倍。经过酶学性质分析结果显示,重组EGI催化反应酶活力的最适温度为50℃,最适pH为6.0,K+和Ba2+离子有一定激活作用,Cu+、Fe3+、Mn2+对酶活性的影响较大,葡萄糖浓度能够影响酶的活性。
其他文献
会议
在植物中,目前已知的蛋白激酶至少有30多种,它们的作用也表现在多个方面,包括向光性、抗寒、抗病、光合作用以及细胞分裂等等,其中CDPK (calcium-dependent protein kinase)是研究的较多的一类依赖于钙离子而不依赖于钙调素的蛋白激酶。研究表明,CDPK广泛存在于各种植物体内,是植物体内最大的钙离子调控蛋白激酶家族。我们用生物信息学的方法,对照水稻和拟南芥中已知的CDPK
  Purpose: To explore the effect of nursing care on increasing the success rate of impression for rehabilitation of maxillofacial defect with prostheses.Metho
会议
  Purpose: Evaluate the potential therapeutic effect of IL-24 against KB(human oral squamous cell carcinoma cells line)and KBv(Vincristine resistant KB cells
会议
  Purpose: The maxillofacial defects lead to dysarthria and dysphagia in many cases.We usually treat with dento-maxillary prosthesis with obturator for these
会议
居住区绿地是城市园林绿地的重要组成部分,是改善城市生态环境的重要环节。随着人们生活水平的提高,居住区绿化愈加受到重视。目前对居住区绿化的研究主要集中在植物造景、植物
  Purpose: In order to get the current distribution range and distribution characteristics of Chinese Han population healthy anterior gingival color chroma va
会议
会议
  Purpose: This study tried to investigate the therapeutic potential of EPCs in treatment of irradiated tissue ischemia in vivo,hoping to provide a new way to
会议
【目的】用含胃泌素(Gastrin)基因的真核表达载体pcDNA3.1/gastrin转染胃癌细胞,获得稳定表达胃泌素基因的胃癌细胞株;研究高表达胃泌素和外源性胃泌素对胃癌细胞增殖、迁移