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纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的可再生资源。目前,自然界中纤维素只有一小部分得到了利用,绝大多数纤维素不仅被白白浪费,而且对环境造成了污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。将里氏木霉纤维素酶内切葡萄糖苷酶基因,用基因工程方法高效分泌表达,并研究其酶学性质,为改进酶学活性提供研究参数,奠定基础。
目前纤维素的研究已经日趋成熟,但对于里氏木霉内切葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质的研究甚少。本文成功的克隆了里氏木霉内切葡萄糖苷酶EGI基因,将其连接到pPIC9K载体,构建了分泌表达型毕赤酵母质粒pPIC9K-egl,并把它整合到了毕赤酵母基因组中,利用甲醇对阳性转化子进行了较为系统的诱导表达条件优化,确立了最佳表达条件为:30℃下,诱导剂浓度为2%,接种量为OD6002.5,氮源为1.0%的蛋白胨,摇床转速为200rpm,起始培养基PH为6.0时酶的活性最高,最大酶活出现在甲醇诱导表达48 h-60h之间。
在摇瓶优化条件的基础上,对毕赤酵母重组子GS115/egl进行了5L发酵罐的高密度培养。将发酵上清超滤浓缩后,采用离子交换的方法进行分离纯化,制备纯酶,并测定其活性和酶学性质。纯化后的酶活性为0.892U/mL,比酶活为11.952U/mg,比未纯化前提高了1.82倍。经过酶学性质分析结果显示,重组EGI催化反应酶活力的最适温度为50℃,最适pH为6.0,K+和Ba2+离子有一定激活作用,Cu+、Fe3+、Mn2+对酶活性的影响较大,葡萄糖浓度能够影响酶的活性。