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SET家族蛋白具有组蛋白甲基化转移酶的功能,可以通过甲基化的修饰作用影响染色体结构来调控基因表达,因此受到研究者的关注。SETD4属于SET家族成员,是实验室前期研究基因特异性调控时发现的,推测可能也具有组蛋白甲基化转移酶的功能。本实验的主要目的是通过建立两种真核表达系统,比较两种系统的优势和劣势,为大量获得SETD4蛋白提供实验依据。同时研究过表达SETD4蛋白对哺乳动物细胞的影响,为深入研究SETD4蛋白的功能奠定基础。论文主要有三个研究内容:(1)建立SETD4昆虫细胞表达系统。首先构建重组载体转座至重组杆状病毒,然后通过脂质体转染使SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒并获得大量蛋白,经过考马斯亮蓝染色和Western Blot鉴定,最后用Ni2+亲和柱来纯化蛋白。(2)建立SETD4哺乳动物细胞表达系统。首先构建真核表达载体pcDNA3-His-SETD4,然后通过脂质体转染至293F悬浮细胞中,最后用Western Blot鉴定蛋白的表达情况。(3)通过MTT实验来检测过表达SETD4蛋白对293A细胞存活的影响,进一步用流式细胞术检测过表达SETD4蛋白是否通过细胞凋亡途径影响其存活率。研究结果如下:(1)在成功构建了重组载体pFast-HTB-SETD4的基础上,成功构建了重组杆粒DH1 OBac-HTB-SETD4;转染后SF9细胞形态发生明显的改变;通过考马斯亮蓝染色及Western Blot检测SETD4蛋白的表达,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50kD处可检测到目的条带,说明通过昆虫系统能够表达SETD4蛋白。(2)成功构建了真核表达载体pcDNA3-His-SETD4,并能够准确表达出带有His标签的SETD4蛋白;通过Western Blot检测转染真核表达载体的293F细胞,用SETD4特异性抗体在50 kD处可检测到目的条带,说明通过哺乳动物系统也能够表达SETD4蛋白。(3)MTT结果显示,过表达SETD4蛋白的293A细胞存活率[(56.7±9.9)%]较对照组[(83.2±12.8)%]和未处理组[(100±0)%]明显降低,并且其差异具有统计学意义(P<0.05)。而流式细胞术结果显示:与对照组和未处理组相比较,过表达SETD4并未引起293A细胞的早期凋亡。根据上述研究结果,可得到以下初步结论:(1)昆虫表达系统具有蛋白产量相对较高,成本相对较低,通过观察细胞形态即可了解病变程度,病毒可以长期储备,能够随时扩增并纯化蛋白等优势。但是该系统重组载体的转座效率较低,构建的时间比较长,需要优化的条件较多。(2)哺乳动物细胞真核表达系统具有构建的时间相对较短,细胞增殖较快,操作简便等优势。但是该系统产物可能对细胞有毒性作用从而影响细胞活力及蛋白的产生,成本较高。(3)过表达SETD4蛋白能够降低293A细胞的活力,但不是通过细胞凋亡途径影响的。综上所述,根据蛋白表达情况,成本等综合因素考虑,SETD4在真核系统中的表达及纯化首选昆虫表达系统。而SETD4蛋白影响细胞活力的具体途径需要后续实验进一步探讨。