论文部分内容阅读
山茱萸(Cornus officinalis)为山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属(Cornus)落叶乔木或灌木,以干燥果皮入药,具有补益肝肾、调节免疫和补气固虚等作用。山茱萸的主要活性成分为环烯醚萜苷类化合物(CIGs),如马钱苷和莫诺苷等,在神经保护、治疗糖尿病、肾病、阻止炎症反应和细胞凋亡等方面具有良好的药用价值。灯台树(Cornus controversa)与山茱萸亲缘关系近,常被作为园艺观赏植物,有药用记载,但有关灯台树入药及其成分的报道很少。目前,有关山茱萸属植物的研究主要集中在种质资源、优良品种选育及栽培、生理和遗传多样性等方面,基因组数据和分子水平上的研究还没有相关报道,尤其是药用活性成分马钱苷的合成和积累机制尚不清楚。近年来,转录组测序技术应用十分广泛,通过转录组数据可以快速获得物种的基因信息数据,为药用活性成分的合成途径、基因克隆和表达等研究奠定基础。本论文选择山茱萸和灯台树为实验材料,通过观察两个物种果实生长期的种质特性,比较分析种间总糖、总有机酸、总环烯醚萜苷和马钱苷含量,采用高通量测序技术建立山茱萸转录组数据库,克隆两个物种马钱苷合成途径中的关键基因(G10H和SLS),并利用Real-time PCR检测基因表达量,结合马钱苷含量的动态变化,初步揭示药用活性成分马钱苷的合成机制和积累规律。主要结果如下:1.比较分析了生长期山茱萸和灯台树果实的种质特性,研究发现:山茱萸果的大小、百粒重和含水率都显著高于灯台树(P<0.05),仅出皮率略低于灯台树。山茱萸果实发育早期果核部分生长较快并骨质变硬,到后期果肉部分显著增加,推测主要是果肉代谢产物的积累。在两个物种整个果实生长期中,果实大小、百粒重和出皮率均随着果期延长逐渐增加,含水率相对比较稳定。2.采用紫外分光光度计和高效液相色谱法等测定了山茱萸和灯台树不同时期不同部位中总糖、总有机酸、总环烯醚萜苷和马钱苷含量,结果发现:山茱萸果中各种成分的含量均高于叶和花,果实在成熟期各个含量均有显著增加(P<0.05);灯台树果中总糖和总环烯醚萜苷含量高于叶和花,总有机酸和马钱苷含量均低于叶和花,果和叶随着果实生长至成熟含量均降低;灯台树果中马钱苷含量很低,极显著低于山茱萸果(P<0.01)。3.以山茱萸果皮为材料,采用高通量测序技术进行转录组测序,共获得了44,718,948条clean reads,拼接组装得到71,842条Unigene。将获得的转录组数据与多个数据库进行比对,总共注释到了 31,780条Unigene。通过与KEGG数据库比对,总共有9,978条Unigene映射到268个代谢通路中,其中,注释到萜类化合物的合成途径有105条,注释到马钱苷合成途径中的关键酶基因约有16种(包括G10H和SLS等)。除此之外,采用MISA软件筛选发掘了 13,719个SSR位点,通过NCBI中BlastX检索与Nr数据库进行比对,总共获得了 1,233条转录因子。4.根据山茱萸转录组数据注释到的基因序列,克隆了山茱萸和灯台树中G10H、SLS基因的保守区序列;采用同源克隆法克隆了灯台树中18S基因的保守区序列;并采用Real-time PCR测定了山茱萸和灯台树中G10H和SLS基因的表达量,结合两个物种中马钱苷的含量,初步分析表明G10H基因表达量与马钱苷含量间存在正相关关系,SLS基因表达量与马钱苷含量间存在负相关关系,但二者相关性均不显著,推测可能与马钱苷合成代谢途径网络复杂,这两个基因可能还参与了其它成分的合成。本研究比较了山茱萸和灯台树种间资源的性状、药用活性成分含量的差异等,通过山茱萸转录组数据克隆了山茱萸和灯台树中马钱苷合成途径的关键基因,初步分析了马钱苷合成途径关键基因G10H和SLS的表达量与含量间的关系,为深入研究环烯醚萜苷类化合物合成和积累的分子机制奠定基础。