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背景:结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种传染性疾病。卡介苗是目前唯一用于预防结核病的疫苗,但其保护效果极不稳定。多表位疫苗(Multi-epitope vaccine)是同时携带多个目标抗原相关表位的疫苗,是近年发展起来的一种新型疫苗。与传统疫苗相比,多表位疫苗能够克服MHC分子限制,可被多种遗传背景的MHC分子识别并结合;在细胞免疫方面具有独特优势,可有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素。结核多表位疫苗能满足不同人群预防结核病的需要,但因多表位抗原本身免疫原性较弱,因此需要佐剂来增强结核多表位蛋白诱导Th1型免疫反应。此外,不同的免疫途径免疫机制不同,且诱导的免疫保护力强弱和维持时间也不相同。因此,为了提高结核蛋白疫苗的保护效果,关键是要筛选合适的佐剂和选择合适的免疫途径。由于MTB是胞内菌、机体抗MTB感染主要是通过Th1型免疫反应,同时巨噬细胞也参与抗MTB感染。因此,结核蛋白疫苗诱导Th1型免疫反应和增强巨噬细胞抗MTB感染是进一步评价其保护性免疫反应的基础。目的:确定多表位蛋白TP15氨基酸序列和碱基序列,原核表达系统获得大量多表位蛋白TP15。MF59和hBCG单独或联合作为多表位蛋白TP15的佐剂制成不同疫苗,以皮下注射和肌肉注射两种不同的免疫途径分别免疫小鼠,通过分析其免疫原性,从而筛选出合适的佐剂和免疫途径。为进一步评价疫苗保护性免疫反应提供研究基础。方法:(1)通过在线表位预测软件BIMAS、NetCTL 1.2及SYFPEITHI对11个MTB膜蛋白进行CTL和Th表位预测,化学法合成表位肽。运用经灭活H37Rv免疫过的小鼠脾淋巴细胞和PPD+/PPD-健康人PBMCs对合成多肽进行体外免疫原性分析,筛选出优势CTL和Th表位。(2)生物信息学确定优势CTL和Th表位串联顺序,并以linker短肽串联成多表位肽蛋白TP15。全基因合成编码多表位蛋白TP15的碱基序列,该序列克隆到原核表达载体、IPTG诱导多表位蛋白在大肠杆菌中表达。层析法纯化蛋白,透析复性蛋白。(3)自制MF59和热灭活BCG(hBCG)佐剂,将不同佐剂单独或联合与结核多表位蛋白TP15配伍制备成不同的疫苗,分别于第1、3、5周通过皮下或肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后解剖。间接ELISA法检测血清抗TP15特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体,TP15体外刺激小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,采用流式细胞术检测IL-2+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞、IL-4+CD4+T细胞和IL-10+CD4+T细胞含量,夹心ELISA法检测巨噬细胞培养上清IL-1β和IL-12含量。结果:(1)借助三种在线表位预测软件初步预测出11个MTB膜蛋白CTL表位31条和Th表位18条(2)候选表位均能体外刺激小鼠脾淋巴细胞和健康人PBMCs分泌IFN-γ;根据IFN-γ水平,进一步筛选优势CTL和Th表位各7条。(3)TP15蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,经DEAE阴离子交换层析纯化、透析复性后得到纯度约为95%,其分子量为25.5KD。(4)MF59和hBCG单独或联合作为TP15抗原佐剂,皮下注射和肌肉注射均能显著提高机体产生抗TP15特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平,且复合佐剂MF59/hBCG的免疫效果更佳;TP15免疫小鼠只产生抗TP15特异性IgG和IgG1抗体、而不产生IgG2a抗体。MF59和hBCG单独或联合作为TP15抗原佐剂免疫小鼠,皮下注射较肌肉注射更有利于产生IgG2a抗体,其中复合佐剂MF59/hBCG疫苗免疫小鼠产生IgG2a抗体效果最好,且IgG1/IgG2a比值显著低于肌肉注射;TP15肌肉注射免疫小鼠产生的抗TP15特异性IgG和IgG1抗体水平与PBS对照组比较,差异无统计学意义而皮下注射免疫小鼠产生的抗TP15特异性IgG和IgG1抗体水平显著高于PBS对照组(5)MF59或MF59/hBCG作为TP15蛋白佐剂皮下注射免疫小鼠,显著增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β和IL-12;而hBCG作为TP15佐剂皮下注射免疫小鼠只显著增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-12。(6)MF59和hBCG单独或联合作为TP15蛋白佐剂皮下注射免疫小鼠,均显著提高脾淋巴细胞分泌IL-12+CD4+T细胞含量,而MF59/hBCG作为TP15抗原佐剂皮下注射免疫小鼠,还能显著提高IFN-γ+CD4+T细胞含量。MF59和hBCG单独或联合作为TP15蛋白佐剂皮下注射免疫小鼠,其脾细胞中IL-4+CD4+T细胞含量与TP15免疫组比较,差异无统计学意义;而IL-10+CD4+T细胞含量显著低于TP15免疫组。结论:通过生物信息学和基因工程技术获得了多表位蛋白TP15,MF59、hBCG或MF59/hBCG作为TP15的佐剂,能增强结核多表位蛋白疫苗免疫原性;MF59佐剂主要诱导Th2型免疫反应,MF59/hBCG则主要诱导Th1型免疫反应且增强巨噬细胞免疫反应。MF59/hBCG作为结核蛋白疫苗的佐剂皮下注射诱导抗MTB感染免疫反应优于肌肉注射。