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人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)位于人类第6对染色体短臂6P21.31-21.33,由一组紧密联锁的复等位基因位点组成。其全长3.6Mb～4Mb,约古整个人类基因组3×109bpDNA的0.13%左右。该复合体编码人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA),包含蛋白编码基因位点超过150余个,约占整个人类基因组已知约3.2万个表达基因的0.5%左右。MHC是迄今所知人类最复杂、最具多态性的免疫遗传系统,也是人类基因组中已知基因最密集的区域。在人类基因组计划(the Human Genome Project,HGP)开始之前,HLA基因复合体即是整个人类基因组中研究最充分的片段。作为人类基因组计划的重点,MH成为1999年人类基因组计划中第一个完成全长测序的基因区域。其后,MHC区域基因数据不断获得更新。根据2009年Shiina等进行的统计,在总共3.78Mb的MHC区域内,已确认基因位点更新为253个。包括HLA基因45个,非HLA基因208个。MHC作为人类已知最复杂、最具多态性的基因区域,具有高度多态性。这种多态性表现为其主要基因位点含有大量的复等位基因,且等位基因的分布具有明显的种族和地区差异,不同地区、不同人群中各等位基因的频率各不相同。截止2017年,国际免疫遗传学信息系统数据库(IMGT/HLA)已公布HLA等位基因16.755个[12]。其中HLA-Ⅰ类等位基因12351个,包括HLA-A等位基因3913个,HLA-B等位基因4765个,HLA-C等位基因3510个。HLA-Ⅱ类等位基因4404个,包括HLA-DRB1等位基因2058个。HLA的这种高度多态性显示了遗传背景的多态性和复杂性。它是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现,使人类具有更大的抵抗入侵病原体的能力,对维持种群的生存与延续具有重要的生物学意义。近二十年来,随着分子生物学技术与HLA DNA测序分型技术应用的不断发展与成熟,HLA新等位基因的发现进入快速发展期。随着中华骨髓库(CMDA)的建立与HLA分型数据的增加以及SBT(Sequencing Based Typing)测序分型技术的建立,在中国人群中不断发现新HLA等位基因。HLA抗体作为HLA应用研究的重要组成部分,对于HLA临床表型分析及移植排斥监测具有重要意义。HLA抗体早期来源主要为妊娠、输血等同种免疫。杂交瘤单克隆抗体技术建立后,其成为制备HLA抗体的主要来源。噬菌体抗体库(phage antibody library)技术又称噬菌体展示抗体文库(phage-display antibody library)技术,是继杂交瘤单克隆抗体技术之后,免疫抗体制备技术发展史上的又一重要技术飞跃。噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来,是噬菌体展示技术和抗体库技术相结合而发展出的一项新型抗体制备技术。噬菌体抗体库技术从根本上改变了传统杂交瘤单克隆抗体的制备流程,绕过了杂交瘤细胞融合和选择性克隆化等流程,大大缩短了制备周期,增殖周期从数月可缩短至数周,极大地提高了制备效率;其抗体库容量可扩大达到106～109个克隆;并可直接获得抗体的基因序列,并可对其进行进一步基因工程改造。在HLA单克隆抗体应用研究领域,噬菌体展示抗体技术研究尚未见报道。我们自2008年起至今已发现确认HLA新等位基因33例,均获得WHO HLA因子命名委员会的正式命名。在论文第一部分,进行了 6个新等位基因的鉴定,并对其变异序列的可能来源进行分析,对其编码蛋白空间分子结构的改变进行初步分析。在论文第二部分,利用原核表达系统,对4例A*24新等位基因:HLA-A*24:191、A*24:224、A*24:225、A*24:257、A*24:02:01(作为标准 A*24等位基因)以及A*24总变异序列(包含A*24:224、A*24:225、A*24:257这3个新等位基因的变异序列)编码分子的重链胞外结构域进行原核表达,然后通过噬菌体展示抗体库技术,针对HLA-A*24:191新等位基因编码的氨基酸变异位点,进行单克隆抗体制备,作为今后对这些新等位基因的分子结构和表达进行进一步的分析和了解的研究工具。第一部分HLA新等位基因的发现鉴定及序列分析目的发现、鉴定分析新的HLA等位基因序列方法1.基因分型:样本HLA-A、B、DRB1位点常规高分辨分型采用HLAPCR-SBT(sequence-based typing)测序分型与基于Luminex液相流式平台的荧光微珠PCR-rSSO(reverse sequence-specific oligonucleotide probe,序列特异性寡核苷酸探针反向杂交)分型方法相结合的方法进行。2.基因序列分析:HLA常规高分辨分型异常样本采用单等位基因特异性单链双向测序技术,使用HLAssureTM SET HLA Typing Kit测序试剂,对每个位点上的两条单倍体上的杂合等位基因,分开进行单独正反双向测序。3.新等位基因编码蛋白分子空间结构预测分析:使用SWISS-MODEL同源建模、Phyre2及RasMol和RCSB PDB Protein Workshop软件,对新等位基因编码蛋白分子空间结构进行模拟分析。结果:1.00333号样本采用Luminex液相流式平台rSSO荧光磁珠反向杂交分型复核,结果显示为A*02:06:01+A*68:01:02,但伴有FP#022、FN#072假反应探针的异常结果。该样本SBT测序复核结果显示A位点序列最匹配结果为A*02:03:01 +A*68:01:02,但存在2个碱基差异,即在第2外显子第98位核苷酸为A(A+A)而非W(A+T),第102位核苷酸为Y(C+T)而非W(A+T)。单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*02:03:01等位基因第2外显子第98位核苷酸发生T->A碱基替代,导致第9位密码子由TTC变为TAC,其编码氨基酸由苯内氨酸(Phe,F)变为酪氨酸(Tyr,Y);第102位核苷酸发生A->C碱基替代,导致相应的第10位密码子由ACA变为ACC,但其编码氨基酸未发生改变。2.01513样本采用rSSO荧光磁珠流式反向杂交分型,结果显示为罕见型DRB1*15:66+DRB1*14:05:01/02,并存在FP#516/517假阳性探针的异常结果。SBT测序分型复核结果显示DRB1位点最匹配结果为DRB1*14:05:01 +DRB1*15:66,但存在2个碱基差异,即在第2外显子第258位核苷酸为T(T+T)而非Y(T+C),第261位核苷酸为Y(C+T)而非T(T+T),存在2个碱基差异替代。单等位基因双向测序鉴定,表明该样本DRB1*15:66等位基因第2外显子第258位核苷酸碱基发生C->T碱基替代,结果导致相应的第57位密码子GAC→GAT;第261位核苷酸发生T->C碱基替代,结果导致相应的第58位密码子GCT→GCC。但这两个密码子的碱基改变都未造成编码氨基酸改变。3.00791号样本SBT测序分型结果显示A*24:02:01序列第2外显子第215位核苷酸为R(A+G)而非G(G+G).存在1个碱基差异替代。单等位基因双向测序鉴定,表明该样本第2外显子第215位核苷酸碱基发生G->A碱基替代,导致相应的第48位密码子发生CGG→CAG,其编码氨基酸由精氨酸(Arg,R)→谷氨酰胺(Gln,Q)。4.00059样本SBT测序分型结果显示A位点序列最匹配结果为A*24:02:01 +A*33:03:01,但在第2外显子第178位核苷酸为Y(C+T)而非T(T+T),存在1个碱基差异替代。单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*24:02:01等位基因第2外显子第178位核苷酸碱基发生T->C碱基替代,结果导致相应的第36位密码子发生TTC→CTC改变,其编码氨基酸由苯丙氨酸(Phe,F)变为亮氨酸(Leu,L)。5.00290样本SBT测序分型结果显示A位点序列最匹配结果为A*24:198 +A*33:03:01,但第2外显子第155位核苷酸为W(A+T)而非T(T+T),存在1个碱基差异替代。单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*24:198等位基因上第2外显子第155位核苷酸碱基发生了 T->A碱基替代,结果导致相应的第28位密码子由GTG→GAG,其编码氨基酸由缬氨酸(Val,V)变为谷氨酸(Glu,E)。6.00550样本Luminex液相流式平台rSSO荧光磁珠反向杂交分型,结果显示为罕见型A*24:02:15+A*02:01:01,并存在FP#043假阳性探针的异常结果。SBT测序分型复核显示A位点序列最匹配结果为A*24:156 + A*02:01:01,但第2外显子第256位核苷酸为S(C+G)而非G(G+G),存在1个碱基差异替代。单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*24:156等位基因上第2外显子第256位核苷酸碱基发生了 G->C碱基替代,结果导致相应的第62位密码子由GAG→CAG,其编码氨基酸由谷氨酸(Glu,E)变为谷氨酰胺(Gln,Q)。以上等位基因序列经IMGT/HLA数据库BLAST检索确认后,递交美国NCBI GenBank数据库,获得注册序列号,然后经EMBL-EBI申报,分别被世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*02:355(00333样本)、DRB1*15:06:02(01513 样本)、A*24:224(00791 样本)、A*24:225(00059 号样本)、A*24:257(00290 样本)和 A*24:191(00550 号样本)。结论发现鉴定6例HLA新等位基因,分别被WHO HLA命名委员会命名为HLA-A*02:355(00333 样本)、HLA-DRB1*15:06:02(01513 样本)、HLA-A*24:224(00791 样本)、HLA-A*24:225(00059 号样本)、HLA-A*24:257(00290 样本)和 HLA-A*24:191(00550 号样本)。第二部分通过噬菌体展示技术制备新等位基因A*24:191编码蛋白单克隆抗体第一章A*24蛋白分子重链胞外结构域的原核蛋白表达纯化目的:对A*24新等位基因重链胞外结构域进行表达纯化,制备原核表达可溶性蛋白。方法:1.以A*24:19、A*24:224、A*24:225、A*24:257新等位基因序列作为模板序列进行蛋白表达。根据新等位基因A*24:224、A*24:225、A*24:257核苷酸序列变异位置,设计将以上3个新等位基因核苷酸变异汇总为A*24总变异序列(A*24 Total Mutation),将 A*24:02:01 作为 A*24 标准蛋白序列。2.基因模板采用重叠延伸PCR法,制备模板基因。使用NcoI、XhoI酶切pET-28a(+)载体。载体连接使用同源重组无缝克隆技术,将目的基因连接入载体进行表达。3.转化使用TOP10感受态细胞,将载体转化入TOP10感受态细胞。并进行克隆鉴定。4.目的蛋白诱导表达采用Transetta DE3细胞作为表达感受态细胞,对目的蛋白进行表达。5.通过超声裂解包涵体,使用Ni-NTA Resin柱纯化法进行可溶性蛋白纯化。6.SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白质量。结果:1.模板重叠延伸PCR鉴定、菌液PCR鉴定结果显示PCR产物大小正确,符合预期标准。2.阳性克隆测序结果显示插入基因片段与目的基因序列一致无误。3.SDS-PAGE电泳及Western Blot结果显示表达蛋白大小正确,该表达可溶性蛋白可用于下·步单克隆抗体鉴定。第二章HLA-A*24:191编码蛋白噬菌体展示库单克隆抗体制备目的通过噬菌体展示技术制备A*24新等位基因单克隆抗体方法1.使用A*24:191变异序列合成多肽免疫5只小鼠,共计4次,其间隔时间为分别为3/2/2周。免疫完成7天后ELISA检测小鼠血清效价。3天后进行免疫终加强。2.终加强免疫完成第2天提取小鼠脾脏RNA,反转录cDNA。3.使用25对轻链基因引物及50对重链基因引物,分别扩增轻链及重链基因。4.使用ApaLI和AscI内切酶,对轻链基因及pHD载体质粒进行酶切。使用NotI和SfiI内切酶酶切重链基因。5.将轻链基因酶切片段与载体质粒连接,脱盐纯化后电转SS320细胞。6.测定轻链子库库容并进行测序鉴定,鉴定合格后提取轻链子库质粒。7.使用NotI和SfiI内切酶进行酶切轻链子库质粒。然后将已酶切之重链基因连接导入轻链子库。8.测定Fab抗体库库容,挑取Fab抗体文库菌落,进行测序验证,对其抗体基因完整性与文库多态性、抗体基因种源及其Germline亚型进行分析。9.Fab抗体库经复苏、接种培养、辅助噬菌体侵染、筛选扩培,完成噬菌体展示抗体库营救扩培。10.进行噬菌体海选、淘选,营救与扩增,ELISA初筛及确认,阳性克隆抗体诱导表达。11.菌液裂解上清与A*24:191表达蛋白进行免疫印迹法检测。结果1.小鼠免疫血清检测结果显示3号小鼠免疫血清效价达到标准。2.琼脂糖凝胶电泳显示小鼠RNA提取质量、轻链和重链基因扩增及酶切结果符合要求。3.轻链子库测定库容为3.6×106pfu,测序分析显示其抗体基因正确插入率为86%(6/7)。4.Fab抗体库测定库容为4.4×l07pfu,测序分析显示其抗体基因正确插入率为80%(16/20)。抗体重链序列分析显示其均为鼠源性抗体序列,Germline亚型分析显示其70%(7/10)分布在IGHV1家族,表明抗体基因完整性与文库多态性均应大于80%。5.经噬菌体展示抗体库营救、噬菌体海选、ELISA初筛及确认,选择一株单克隆菌液裂解上清与A*24:191表达蛋白进行免疫印迹法检测,显示所制备该株噬菌体单克隆抗体可与目的蛋白以较高亲和力结合。