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随着二十一世纪的到来,人口老龄化已成为影响人类发展的重要问题之一。老龄人群具有心血管疾病发病率高的特点,高血压、冠心病、心功能不全等心血管疾病发生率随增龄急剧上升,在这些心血管疾病中存在着明显的心血管老化的表现。因此,针对这一庞大的老龄人群,研究心血管衰老,即随着增龄心血管系统结构和功能发生的特征性改变将成为热点。人参、三七、川芎属于中药益气活血药范畴,中医学认为其有“延年不老”的功效。现代药理学研究显示,3种药物的有效成分与抗衰老作用密切相关。本研究以血管老化为研究对象,观察血管壁结构和功能的变化,阐明益气活血中药延缓血管老化的细胞和分子机制,为中药延缓血管老化提供实验依据。
本论文分为三部分:文献综述、基础研究和临床文献系统评价。
1.文献综述通过对87篇文献的阅读、整理和总结,探讨和综述了细胞衰老与血管老化的关系及其研究进展,并对中医学对衰老和血管老化的认识进行了初步总结,提出今后中医药研究血管老化的方向。
2.基础研究包括以下三个基础实验:
实验一:益气活血中药延缓衰老小鼠血管老化的实验研究
目的:探讨衰老小鼠血管老化所导致的血管壁结构和功能的改变以及益气活血中药人参、三七、川芎提取物的干预作用。方法:建立自然衰老小鼠模型,小鼠分为衰老模型组、人参三七川芎提取物高、中、低剂量组、维生素E组(VitE组)、另设青年对照组,观察各组主动脉形态学改变,检测血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量、血管组织抗超氧阴离子、晚期糖基化终末产物(AGEs)、基质金属蛋白酶(MMP-2)与其抑制剂(TIMP-2)以及两者之比MMP-2/TIMP-2。结果:人参三七川芎提取物能够改善衰老小鼠主动脉形态学衰老变化,降低血管组织中活性氧的生成,减少AGEs生成,抑制MMP-2的活性,调节MMP-2/TIMP-2的平衡。结论:人参三七川芎提取物能降低衰老小鼠血管的僵硬度、减少血管重构,延缓小鼠血管老化的发生。
实验二:益气活血中药延缓.AngⅡ诱导内皮细胞衰老的机制研究
目的:观察AngⅡ诱导的内皮细胞(HUVECs)衰老的病理变化,以及人参、三七、川芎提取物的干预作用和机制。方法:体外培养的内皮细胞加入终浓度为10-6mol/L AngⅡ诱导细胞衰老,造成内皮细胞衰老模型。细胞分为空白对照组、AngⅡ衰老模型组、人参三七川芎高、低剂量组和缬沙坦组,采用SA-β-半乳糖染色法观察细胞衰老改变,流式细胞仪分析细胞周期,激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量,硝酸还原酶法检测培养液一氧化氮(NO)和抗超氧阴离子水平,western-blot方法检测各组细胞AngⅡ1型和2型受体(AT1R和AT2R)、NAD(P)H氧化酶p47phox的蛋白表达。结果:高、低剂量中药处理后改善了细胞的衰老状态,β-gal染色阳性细胞数减少,G0-G1期细胞减少,G2-M期细胞增加,ROS荧光强度减弱,抗超氧阴离子、NO含量较.AngⅡ衰老模型组增加,p47phox蛋白表达下调,AT1R蛋白表达较AngⅡ衰老模型组上调。结论:人参三七川芎提取物能够延缓AngⅡ诱导的HUVECs衰老,可通过AT1R下调NAD(P)H氧化酶p47phox表达,进而使ROS产生减少,达到延缓内皮细胞衰老的目的。
实验三:益气活血中药延缓内皮细胞复制性衰老的机制研究
目的:观察内皮细胞复制性衰老的病理变化,以及人参、三七、川芎提取物的干预作用和机制。方法:体外培养的HUVECs传至第8代,造成内皮细胞复制性衰老模型。细胞分为8代衰老模型组、人参三七川芎提取物高、低剂量组、Vit E组,采用SA—β-gal染色法观察细胞衰老改变,流式细胞仪分析细胞周期,激光共聚焦显微镜观察细胞内ROS含量,硝酸还原酶法检测培养液NO和抗超氧阴离子水平,western-blot方法检测各组细胞.AT1R和AT2R,NAD(P)H氧化酶p47phox的蛋白表达。结果:高、低剂量中药处理后,β-gal染色阳性细胞数减少,G1-G1期细胞减少,G2-M期细胞增加,ROS荧光强度减弱,抗超氧阴离子、NO含量较8代衰老模型组增加,p47phox,AT1R,AT2R蛋白表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:人参三七川芎提取物能够延缓内皮细胞复制性衰老,通过活性氧途径下调NADPH氧化酶p47phox的表达,最终使ROS产生减少,可能是其延缓内皮细胞衰老的主要因为之一。
3.临床文献系统评价中国人群中老年人冠心病与血管老化相关指标关系的Meta分析
目的:对中国人群中老年人冠心病与血管老化相关指标关系进行系统评价。方法:①以[(冠心病)and(全部检索条目:踝臂指数or脉搏波速度or脉压差or IMT)]的检索式检索中国生物医学文献光盘数据库,年限为1994年1月至2008年12月。②由2位研究者按照文献纳入、排除标准独立进行文献筛选,意见不同者通过讨论解决。③获取文献的相关研究特征资料,并加以评价。④对合格的病例对照试验,进行定量的Meta分析。结果:①共检索到44个文献。②经两次筛选,剔除不符合要求以及重复报道的文献,最终共有14篇文献入选评价。③14篇文献进行Meta分析程序,总病例数1474例。Meta分析显示,中老年冠心病组ABI结果明显低于对照组,冠心病组PWV、脉压差和IMT结果明显高于对照组。结论:中老年人群中冠心病人比非冠心病人与血管老化相关指标关系更密切,冠心病患者存在更加明显的血管老化现象。但受到各种偏倚的影响,尚需要进行多中心、大样本的临床研究,提高相应系统评价结果的力度。