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环L-苯丙氨酸L-脯氨酸(cyclo-(L-Pro-L-Phe),cFP)是一种非常重要的天然产物,已在多种细菌和真菌的次生代谢产物中被报道。国内外研究已发现cFP具有抗真菌、抗细菌、抗病毒和诱导群体感应等多种生物活性,这些优良特性使得cFP在植物病害的生物防治上有广阔的应用前景,此时,高效生物合成cFP就成为关键,然而目前关于cFP生物合成的调控机制仍未完全明确。最近国内有研究发现洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)CF-66能产生对半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)菌丝生长有明显抑制效果的cFP。有趣的是,我们研究也发现实验室前期从稻田土壤分离获得的一株拮抗细菌Burkholderia seminalis R456及其代谢物能够显著抑制小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum,Fg;禾谷镰刀菌)的菌丝生长,这些结果使得我们有理由推测cFP或许是拮抗细菌R456抑制Fg的活性物质之一。本研究基于这一假设,开展了以下工作:为搞清楚R456拮抗Fg是否至少部分由于分泌抗菌物质cFP,首先利用平板对峙法测定了实验室前期构建的菌株R456的997个Tn5插入突变体对Fg的拮抗效果,获得了拮抗效果增强(与野生型相比增强20%以上)的突变体8个(编号为88、189、117、113、885、495、268和255),拮抗效果减弱(与野生型相比减弱20%以上)的突变体5个(编号为216、123、85、224和225);然后利用高效液相色谱(HPLC)分析了上述13个拮抗效果显著改变的Tn5突变体的上清滤液,结果发现突变体88相对于其它突变体和野生型,在20 min的出峰时间点有一个明显的差异峰,且相同实验条件下该差异峰的出峰时间与人工合成的cFP标准品基本一致;接着对这个差异峰进行LC-MS分析,一级质谱图结果显示其相对分子质量为245.12,与cFP的相对分子质量接近,二级质谱图结果显示其共有7个碎片峰,相对分子质量分别为65.04、70.06、92.05、154.07、172.11、217.13、245.12,与cFP的化学结构接近。最后平板拮抗实验结果显示,菌株R456生物合成的cFP和人工合成的cFP都能强烈抑制Fg的菌丝生长,且拮抗效果在0.1-1000 ppm范围内随着浓度的增高而增强。为探究拮抗细菌R456抗菌物质cFP的合成调控机制,首先,我们通过反向PCR扩增上述13个拮抗效果改变突变体的插入位点基因序列,并将测序结果与R456全基因组进行比对分析,成功鉴定出突变体88插入位点所在基因为Dct转运系统【负责四碳二羧酸C4-dicarboxylates(dCAs)转运,主要成分为Dct-A,-B,-D】中的DctB。接着构建了Dct转运系统主要组份-A,-B,-D的基因敲除突变体和回补体,并利用HPLC测定其上清滤液中的cFP含量,结果显示,Dct(-A、-B和-D)突变体的cFP含量相比野生型有明显上升,但相应回补体的cFP产量与野生型无显著差异,显示R456的cFP合成与Dct转运系统密切相关。最后,利用HPLC分析了Dct转运系统底物dCAs对R456及其突变体中cFP产量的影响,实验结果显示,在野生型菌株中添加草酰乙酸、苹果酸、天冬氨酸和琥珀酸等dCAs,会导致其cFP产量与对照相比显著下降,而在Dct转运系统的3个突变体菌株(Dct-A、-B和-D)中添加上述四种dCAs,其cFP产量与对照相比无明显变化,说明dCAs能够负调控菌株R456中cFP的合成。综上所述,本研究清楚地显示cFP是菌株R456拮抗Fg的主要活性物质之一,其生物合成受到dCAs的负调控。