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背景目的： 传统的致病菌检测鉴定主要依据形态特征和生理性状，采取的主要方法是对细菌进行增菌、分离、纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征、血清免疫学，酶免疫技术等加以鉴定。传统方法虽然可靠，但耗时耗力，不能满足现代疾病诊断治疗的速度要求。近年来，由于测序技术的提高和普及，国际DNA序列数据库及比对程序的完善，使得测序逐渐地开始应用于病原菌的检测。测序法与其它分子生物学方法相比，其最大的优点在于无需借助与标准菌株的比对，便可直接得出结果，也无需使用其它方法进行确证，是细菌鉴定的金标准。本研究旨在改良传统Sanger测序技术，建立16S rRNA基因快速测序法，并应用于常见病原微生物的鉴定及同源性分析，同时也探索了其他遗传标记在鉴定和同源性分析中的作用。 材料方法： 首先，为优化FTA卡作为DNA模板制备的条件，以金黄色葡萄球菌菌株为样品，将不同浓度菌液滴在 FTA卡上，并用打孔器打出不同直径卡片，分别进行荧光 PCR-16S rDNA测序，根据荧光PCR的Cp值和测序结果优化最合适的FTA卡制备DNA模板条件。其次，为了对比本实验方法较于传统Sanger测序方法而言在各方面（包括鉴定结果，操作技能要求、测序质量，工作量，时间，费用）是否存在优势，先进行小样本（12株菌，每种菌4个样本，其中一个样本为标准菌株）预实验。再次，以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌大样本（各30株）为实验对象进行预试验和方法验证，建立16S rRNA基因快速测序细菌鉴定方法：用适当浓度的菌液制备FTA样品卡，取直径0.5mm的FTA卡，SYBR GreenⅠ荧光PCR直接扩增法获得16S rRNA基因片段，PCR产物简单稀释后进行 Sanger测序，测序产物经毛细管电泳后其结果使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的nucleotide blast工具进行匹配分析，获得细菌鉴定结果。最后，为了探索其他遗传标记的作用，分别针对三种菌的23S-5S rRNA基因间隔区间序列自行设计特异性引物，每种菌各取4个样本（1株标准菌株和3株分离自不同临床菌），按16S rRNA的实验条件和方法流程进行操作，个别步骤作了相应的优化。 结果： 1、采用直接扩增法进行SYBR Green荧光PCR反应时，在直径为0.5、1.0和2.0 mm的卡片中，只有0.5 mm的卡片得扩增产物。6.0×104~7cfu/ml菌液制备的FTA样品卡， SYBR Green荧光PCR扩增的Cp值在14.8~28.2范围内，其测序产物数据较为理想。 2、对比试验中，12株菌株测序质量经量化后统计分析，发现本实验方法稍劣于传统方法。但是对这12株菌株的鉴定结果，两种方法均一致且准确。方法对比的其余指标，如操作技巧要求、工作量、耗时、费用等，分别为低vs高、轻松vs繁重、8h vs11h/12个样品和$420 vs$400/12个样品。 3、采用本方法进行大样本细菌鉴定时，所有90个样本的目标序列均可以测序成功。其中，所有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均可获得与传统生化方法完全一致的鉴定结 果，而在30株传统方法鉴定为“大肠埃希氏菌”的样本中，只有8株（26.7％）被鉴定为大肠埃希氏菌，有10株（33.3%）被鉴定为宋氏志贺氏菌，12株（40%）被鉴定为痢疾志贺氏菌。 4、采用本方法测定3种菌的23S-5S rRNA基因间隔区序列时，金黄色葡萄球菌与大肠埃希氏菌样本均可获得清晰可辨的测序结果，且比对分型结果显示均可得到准确鉴定，匹配率达到99%。但铜绿假单胞菌序列出现双重片段，无法直接通过序列比对获得鉴定结果。 结论： 1、6.0×104~7cfu/ml菌液制成的FTA样品卡，打出直径为0.5 mm卡片，适于荧光PCR-16S rRNA基因测序法鉴定细菌。 2、从操作技巧要求、工作量、耗时和综合比较来说，本实验的新组合方法优于传统测序方法。 3、本方法可快速、可靠、稳定、方便地进行16S rRNA基因测序，适用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的快速准确鉴定，但由于无法区分大肠埃希氏菌和某些志贺氏菌，不完全适用于大肠埃希氏菌鉴定。 4、23S-5S rRNA基因间隔区序列测序可鉴定黄色葡萄球菌与大肠埃希氏菌，具有敏感、特异、快速、准确的优点，为致病菌的快速鉴定提供了另一种选择。而应用于铜绿假单胞菌则需要进一步探索。