中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取纯化及性质研究

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胶原(Collagen)是由三条肽链组成的螺旋形、纤维状蛋白质,富含于动物的骨、结缔组织和皮肤中,组成胶原分子的肽链被称为胶原蛋白。中国林蛙是重要的特种经济动物,提取林蛙卵油后留下大量的蛙皮废弃物中富含胶原蛋白。研究表明,胶原蛋白具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和低抗原性,因此应用领域广泛。主要用于生物医学材料、食品、营养保健品、化妆品等。本文为了充分利用中国林蛙资源,对蛙皮胶原蛋白进行了提取纯化和性质研究。通过测定,得到林蛙皮肤中胶原蛋白含量不少于26%,是一种很好的胶原蛋白提取原料。为提高测定数据的准确性,对消解测定方法进行了修正,建立了适用于中国林蛙皮肤胶原蛋白含量的计算公式,添加了校正因子λ=1.23。并最终得到适合于中国林蛙皮胶原蛋白含量测定的计算公式:M0=(C×稀释倍数×总体积/换算系数)×λ。本试验采用酸酶结合提取,破坏一部分肽键,使得胶原变成可以被醋酸溶解的可溶性胶原蛋白,从而达到提取的目的。对酸酶结合提取条件进行了优化,优化后的提取条件为:m(胃蛋白酶):m(原料)=1:50,提取温度37℃,保温时间72h,提取缓冲液50ml 0.5mol/L冰醋酸,提取两次,最终的提取率可达到81.66%,正交试验方差分析表明,酶解温度是影响提取率的重要因素,对结果的影响最为显著。对提取得到的胶原蛋白溶液进行纯化。经过超滤浓缩、盐析沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等纯化步骤后,胶原蛋白溶液浓度达到34.5g/L,纯化倍数为2.326倍,纯度达到96.1%,胶原蛋白总质量1.04g,回收率为39.8%。真空冷冻干燥得到胶原蛋白产品,外观呈松散的絮状,白色略带黄,密度极低,约为0.002g/cm3,极易吸水,吸水后有粘滞感,易粘手,聚成片状。经测定中国林蛙皮肤胶原蛋白的含水量为16.44%。等电点为5.8。在273.5nm处有一个较明显的紫外吸收峰。经SDS-PAGE电泳测定,得到两条较明显的条带,分子量分别为107KD和89KD左右,说明本试验得到了胶原分子解链后的两个α组分蛋白。本文首次以中国林蛙皮肤为原料进行胶原蛋白的提纯和性质研究,为深度开发林蛙资源、节约成本做出了有意义的探索。
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