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目的和意义：恐怖主义袭击、自然灾害和人为劣质工程将会造成各类地面建筑物及地下工程设施的坍塌,被埋压废墟内人员常因缺氧窒息和/或复合创伤而死或预后不良。同时,临床上与缺氧相关的疾病也呈增多趋势。在机体所有器官中,脑对氧浓度的变化最为敏感,即使在遭受相同程度、相同时间的缺氧应激后,脑组织的损伤也最为严重,且当损伤到一定程度时则难以逆转,在治疗上尚缺乏特效的手段。迄今有关常压缺氧条件下,机体应激所造成的脑损伤效应及其机制和防治等相关性研究甚为鲜见。本研究旨在通过系统探讨机体于常压缺氧应激状态下,脑组织的生理、病理变化。从整体水平研究机体对不同程度缺氧的耐受性;从组织、细胞和超微结构水平研究脑组织缺氧性改变的特点、程度和规律,并从组织、细胞和超微结构水平研究不同脑区组织对缺氧适应的改变;从分子水平利用蛋白质组学的研究方法,探讨脑组织于缺氧早期适应过程中相关蛋白质的表达变化,并对缺氧后脑早期适应的分子机制进行初步探讨。 本课题对缺氧性脑组织损伤及损伤后修复机制的研究,将为各类常压状下缺氧性脑损伤选择合适的干预措施,减轻脑损伤后遗症提供依据,同时对临床医学(如缺氧性脑病)、航空航天医学、高原医学、海洋医学、运动医学等也具有一定的参考意义。 材料与方法：(1)采用电子控制设备、制氮设备和钢化玻璃等新型材料独立设计建立常压低氧生物医学实验舱,用氮气将舱内自然成份的空气排出,人为地降低舱内氧的百分含量,造成常压低氧环境;(2)用Wistar大鼠220只,雌、雄各半,在3-10％氧浓度环境中进行缺氧耐受性实验,并对其动脉血行血氧分析;(3)利用光镜、特殊染色和电镜对7％氧浓度环境中不同持续时间(1d、3d、5d、7d、10d、14d)的120只大鼠,雌、雄各半脑组织进行病理学动态观察,并利用细胞计数和病理图像分析系统分析缺氧变性细胞发生率的变化;(4)通过基于2DE、质谱鉴定、生物信息学分析的比较蛋白质组学方法研究持续缺氧7d和14d大鼠大脑前回蛋白质表达谱的变化,探讨缺氧对脑组织损伤的规律和机制。 实验结果：(1)自行建成的大型生物医学低氧实验舱,氧浓度可调范围2％～20％,经验证、鉴定,该系统在环境温度低于28℃时,可连续稳定工作504h。舱内氧浓度测定值与设定值无显著差异,已在12项课题的比格犬、恒河猴、大鼠、小鼠、家兔、C57转基因小鼠进行缺氧性实验中应用,性能稳定、可靠;(2)大鼠在3％-6％氧浓度环境中临床经历痉挛期、昏迷期和濒死期,1w内的死亡率为100％。氧浓度在3％-4％时,雌性大鼠平均耐受时间分别为17.80±4.18min、17.60±4.12min;雄大鼠的平均耐受时间分别为7.00±5.35min、16.80±3.85min。5％～6％时,雌性大鼠平均耐受时间分别为1276.00±986.83min、1524.0±915.26min;雄性大鼠平均耐受时间分别为122.00±51.06min、655.00±414.25min。7％氧浓度时,仅有雄性大鼠死亡,死亡率为30％,其余动物经历代偿期和适应期。8％～10％氧浓度中1w内大鼠无死亡。雌性大鼠对缺氧耐受的时间比雄性显著延长;(3)7％氧浓度环境中,大鼠不同脑区神经元细胞及胶质细胞均随缺氧持续时间延长发生逐渐加重的缺氧性改变。光镜表现为神经元缩小、胞浆嗜酸性增强,尼氏体减少,胞核浓缩,形态不整;部分胶质细胞变性、凋亡。电镜表现为细胞形态不整,胞膜部分溶解,内质网扩张、脱颗粒,线粒体肿胀,嵴断裂、溶解,均质化甚至空泡化。胞内出现溶酶体较多。核膜部分溶解,染色质边集,核仁消失。微血管内皮细胞、周细胞轻度变性。上述变化于缺氧持续7d时达到高峰。当持续缺氧10d时,上述损伤减轻,持续缺氧14d时,损伤组织明显减轻甚至部分恢复。图像分析结果表明,持续缺氧1d～7d时,变性细胞数进行性增加,尼氏染色光密度进行性减弱,于持续缺氧10d～14d时,变性细胞数进行性减少,尼氏染色光密度进行性增强。其中,雄性大鼠神经元及胶质细胞进行性变性速度快于雌性,但其恢复也快于雌性;(4)血气分析结果显示,缺氧过程中,动脉血pO2、pCO2、pH值和Ca2+浓度下降。持续缺氧1d～7d时,雄性动脉血上述指标进行性下降,且下降幅度大于雌性。于持续缺氧10d～14d时,pH值又呈进行性上升趋势。动脉血Ca2+浓度从持续缺氧1d～10d时显著低于对照组(p<0.05,p<0.01),于持续缺氧14d时,雌性动脉血Ca2+浓度已接近对照组;(5)持续缺氧7d时,雌、雄各有173和139个差异蛋白点,14d时,雌、雄各有151和89个差异蛋白点。经验证大脑前回组织表达的差异蛋白有29个,主要涉及能量代谢、细胞骨架、信号转导、生物合成、神经递质、应激和功能未知蛋白。其中,缺氧7d时,有氧氧化、细胞骨架、生物合成的蛋白质表达下调,14d时表达有上调趋势,无氧酵解、信号转导的蛋白质表达上调。 结论： 1.设计并成功建成可用于大、中、小型动物缺氧性实验的大型全自动常压低氧生物医学实验舱,舱内氧浓度可调节范围2～20％,工作性能稳定、可靠,可连续运行504h,国内尚未见同类报道。 2.明确了大鼠对不同程度缺氧环境的耐受力及耐受时间:氧浓度在3％-6％时,动物全部死亡,属极重度缺氧。氧浓度在7％时,属重度缺氧,动物1w内的死亡率是30％。8％-10％时,属中度缺氧,动物1w内无死亡。 3.氧浓度为7％时,实验动物虽有少数死亡,但存活动物经历典型的缺氧急性代偿性和适应性变化过程,是研究哺乳动物对缺氧适应的适宜浓度。 4.不同脑区对缺氧的敏感性依次为大脑前回>小脑>延脑>大脑顶叶>海马。各脑区均于持续缺氧7d时损伤最重,于第10d已见修复,前回修复早于其它脑区,小脑、延脑、大脑顶叶和海马相对延迟。雄性大鼠对缺氧的适应早于雌性。 5.缺氧过程中,脑组织各类细胞均可发生缺氧性改变,其中神经元的变性重于神经胶质细胞,小脑蒲肯野细胞重于颗粒细胞。 6.经生理、病理学系统对比性动态观测表明,脑组织的缺氧性损伤病变具有累及部位的全脑性、损伤细胞的广泛性、病程发展的阶段性以及不同脑区不同类型细胞对缺氧敏感程度的差异性四个主要特点。 7.在缺氧过程中,动脉血pH值和Ca2+浓度均低于对照组,表明细胞损伤与细胞酸中毒、胞内Ca2+超载有关,Ca2+超载可能是细胞损伤的直接原因。 8.7％氧浓度环境可致大鼠大脑前回组织总蛋白表达谱发生变化,雌性差异蛋白点多于雄性。经鉴定,发现29个差异蛋白,分别涉及能量代谢,信号转导、细胞骨架、生物合成、神经递质及不明功能的蛋白,其中涉及信号转导的蛋白多达7个,提示,上述各类差异蛋白参与了缺氧所致脑损伤及其适应的发生、发展过程。 9.缺氧7d时,与有氧氧化的细胞色素C氧化酶、参与TCA的谷氨酸脱氢酶及微管蛋白的表达下调,而参与无氧酵解的丙酮酸激酶等酶类上调;缺氧14d时,除有氧氧化的酶类仍然下调外,涉及无氧呼吸、生物合成、炎性反应、骨架蛋白和信号转导的蛋白质与缺氧7d时相比均呈上调趋势。在差异蛋白中,以信号转导者居多。提示,缺氧致神经组织的损伤和早期适应与多种蛋白的表达变化和多条信号途径的改变有关。