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基因组完整性的维持在于DNA准确的复制与修复。DNA聚合酶在上述过程中发挥重要作用。目前DNA聚合酶分为经典性DNA聚合酶和特异性DNA聚合酶。经典性DNA聚合酶主要执行复制DNA的任务;特异性DNA聚合酶在跨损伤DNA合成、DNA损伤修复及基因重组中发挥重要作用。 DNA聚合酶λ（polλ）是在2000年被发现的特异性DNA聚合酶，属于DNA聚合酶的X家族。polλ的N端含有BRCT功能域(Breast Cancer Gene1 C-terminaldomain)和脯氨酸/丝氨酸富集域。3D结构分析表明BRCT结构域具有介导蛋白与蛋白，蛋白与DNA之间相互作用的功能。脯氨酸/丝氨酸富集域为polλ所特有，参与polλ聚合酶活性的负性调控。虽然polλ的生物学功能目前还不清楚;polλ的生化特性提示它在非同源末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)修复中发挥重要作用。 电离辐射、一些化疗药物及V(D)J重组会引起DNA双链断裂(DNADouble-Strand Breaks，DSBs)，可通过NHEJ和同源重组(HomologousRecombination，HR)两种途径修复。NHEJ被认为是哺乳动物细胞修复双链断裂的主要形式，其连接断裂DNA双链不需要断裂末端存在广泛同源序列。NHEJ修复过程如下:断裂的DNA末端首先被Ku蛋白对齐→后者募集并先后活化DNA-PKcs、Artemis和XRCC4→MRE11-RAD50-NBS1复合物和Artemis修剪DNA末端，使之错误配对形成具有短空缺DNA二聚体→DNA聚合酶填充空缺→XRCC4-LigⅣ连接DNA末端而恢复DNA结构的完整性。 关于执行空缺填充功能的聚合酶目前尚不清楚。据报道TdT、polμ及酵母polⅣ均有可能参与NHEJ的修复过程。基于polλ与前三者在结构和功能上的相似性，本研究拟通过体内、外实验相结合的方法，探讨polλ在NHEJ中的作用以及polλ与XRCC4-LigⅣ的相互关系。 一、polλ及两种突变体polλΔ1、polλΔ2质粒构建，蛋白表达纯化和活性分析 1.Polλ及两种突变体pET28a-po1λΔ1、pET28a-polλΔ2质粒的构建、表达及重组蛋白的纯化 通过PCR从胎盘cDNA中扩增polλ的全长cDNA，大小约1743 bp。将其插λpET28a质粒，并转化大肠杆菌BL21。酶切图谱分析和测序结果均证实pET28a-polλ重组质粒构建成功。用IPTG诱导细菌表达的目的蛋白在68kDa处出现蛋白条带，与polλ预期的分子量一致;目的蛋白多分布于细胞质中。 为了研究BRCT结构域和脯氨酸富集域对polλ功能影响，我们以pET28a-polλ重组质粒为模板，用PCR方法获得两个polλ的缺失突变体:polλΔ1缺失BRCT结构域，polλΔ2缺失BRCT结构域和脯氨酸富集域。并将其克隆表达和纯化。Polλ的分子量大约为68kDa，polλΔ1约59kDa，polλΔ2约40kDa。 2.纯化蛋白polλ、polλΔ1及polλΔ2的聚合酶活性分析 聚合酶活性的剂量和时间效应曲线显示polλ及其突变体的活性在一定的范围内随剂量的增加和作用时间的延长而增高，polλ和polλΔ1聚合酶活性无明显差异，而polλΔ2的聚合酶活性却明显增高（约是前两者的2.5-3.3倍左右）。polλ、polλΔ1、polλΔ2的活性单位分别为4.38、4.87、16.12 unit/μg。上述结果表明BRCT结构域对polλ的聚合酶活性无影响，而脯氨酸富集域可抑制polλ的聚合酶活性。 二、纯化蛋白polλ、polλΔ1及polλΔ2体外空缺填充(gap filling)实验 将polλ及其突变体分别与三种不同长度空缺的DNA底物作用不同时间。其结果显示(1) polλ与polλΔ1可填充1、3、5个核苷酸空缺，分别形成21、23、25个碱基的完全填充核苷酸产物。密度扫描显示，随作用时间延长，完全填充产物的产量逐渐上升。上述结果表明polλ是以模板依赖性、连续性方式填充空缺的，且无明显的链取代作用。此外，BRCT结构域并不影响polλ的空缺填充功能。(2) polλΔ2虽然可填充不同长度的空缺，但其填充空缺的长度远超过空缺大小，在20nt的P4寡核苷酸末端添加了17nt至30nt，生成37nt至50nt的寡核苷酸产物，有很强的链取代活性。上述结果提示polλ的赖氨酸富集域具有抑制链取代活性的作用。 三、Polλ及其两种突变体与XRCC4-LigⅣ在体外的相互作用 斑点杂交结果显示polλ可与XRCC4-LigⅣ复合体结合，并有明显的剂量效应关系;而polλΔ1、polλΔ2及polβ则无明显结合效应。上述结果表明polλ能够与XRCC4-LigⅣ复合体相互作用，且相互作用是通过BRCT结构域来实现的。 进一步通过pull down实验证实只有野生型polλ与XRCC4-LigⅣ复合体反应，可检测到XRCC4蛋白，并且有剂量依赖关系;而polλΔ1、polλΔ2及polβ组则不能检测到XRCC4蛋白的存在，提示polλ是通过BRCT结构域与XRCC4-LigⅣ复合体相互结合的，因为polλΔ1、polλΔ2及polβ缺失BRCT结构域，从而不能与XRCC4-LigⅣ复合体结合。 四、XRCC4-LigⅣ复合体对三种纯化蛋白空缺填充实验的影响 1.对空缺填充实验的影响 将不同浓度的XRCC4-LigⅣ蛋白分别与polλ及其突变体与3nt空缺的DNA底物共同孵育，结果显示随着XRCC4-LigⅣ蛋白浓度升高，polλ填充空缺功能增强，当XRCC4-LigⅣ浓度达到5nM时，完全空缺填充产物产量增加近4倍。polλΔ1及polλΔ2的填充空缺功能则不受XRCC4-LigⅣ的影响。上述结果提示XRCC4-LigⅣ复合体可以促进polλ的空缺填充功能，并且此促进作用与BRCT结构域有关。 2.对空缺填充耦联连接反应的影响 不同浓度的XRCC4-LigⅣ复合体与Polλ及突变体、可连接底物相互作用，结果显示随着XRCC4-LigⅣ复合体浓度增高，polλ的62-nt连接产物量也增加。当XRCC4-LigⅣ为5nM、10nM时，62-nt连接产物量占总量的比例由1％上升到9％、17％。polλΔ1及polλΔ2则无62-nt连接产物。上述结果提示polλ及XRCC4-LigⅣ复合体的共同作用可成功完成底物的空缺填充及末端连接，而且该作用依赖BRCT结构域。 五、Polλ与XRCC4-LigⅣ在体内的相互作用 CPT可以引起DNA双链断裂，生理剂量的UV很少引起双链断裂。我们进一步观察polλ在体内DNA双链断裂NHEJ修复中的作用及与XRCC4-LigⅣ的相互关系。 1.不同剂量UV、CPT处理后HeLa细胞中polλ和XRCC4分布情况 用不同剂量UV(2、5、10 J/m2)及CPT(1，5，15μ M)处理HeLa细胞，提取细胞核蛋白及细胞质蛋白，用Western blot证实随着CPT剂量的增加，polλ及XRCC4在细胞核逐渐增加，而在细胞质则逐渐降低。UV处理对细胞核及细胞质中polλ及XRCC4的量均无影响。提示细胞内的双链断裂可以特异性地诱导polλ和XRCC4向核内转移，参与核内DNA双链断裂的修复。 2.Polλ与XRCC4-LigⅣ在体内的相互作用 将HeLa细胞经不同剂量UV及CPT处理后，用免疫共沉淀、pull down实验及免疫荧光来观察XRCC4-LigⅣ与polλ相互作用变化。免疫共沉淀结果显示XRCC4-LigⅣ与polλ的结合随着CPT剂量增高而加强，但不随UV剂量改变而变化。Pull down结果与免疫共沉淀结果一致。免疫荧光实验表明，在未经处理的HeLa细胞核中polλ和XRCC4-LigⅣ均呈弥散分布，当用15μM CPT处理HeLa细胞后，细胞核内polλ与XRCC4-LigⅣ均形成核焦点(nuclear foci);而且两者的核焦点大多重叠在DNA所在位置，计数结果显示平均每个细胞中有45个共定位的核焦点。用10J/m2 UV处理细胞，核内polλ与XRCC4-LigⅣ同样形成核焦点;但是两者的核焦点很少重叠，平均每个细胞中只有3、4个共定位的核焦点。上述结果提示CPT处理诱导的DNA双链断裂可明显促进XRCC4-LigⅣ与polλ在体内的结合，而UV照射诱导的非双链断裂DNA损伤则与之无关。 综上所述，我们成功地纯化了polλ重组蛋白及两种突变体重组蛋白。首次用纯化蛋白证实了polλ可参与DNA双链断裂的NHEJ修复途径的空缺填充，且可通过BRCT结构域与XRCC4-LigⅣ复合物结合，增强其空缺填充反应，并与末端连接反应耦联;体内实验同样表明polλ和XRCC4-LigⅣ复合物共同参与胞内的DNA双链断裂修复过程，提示polλ在NHEJ途径中是最可能参与空缺填充的DNA聚合酶。