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互花米草是一种高度耐盐的盐生植物,可能存在其独特的抗逆机制,解除活性氧毒害的机制也可能异于其他植物。因此,从盐生植物互花米草中克隆活性氧清除酶类基因并分析其功能,可能有助于理解植物中氧化胁迫的耐受机制。 本实验较系统地研究了高浓度NaCl处理下,互花米草叶片中清除Ο?2和H2O2的各种酶(SOD、CAT、APX)的活性,并结合其它生理指标阐明它们在互花米草耐盐性中的作用,旨在了解互花米草的耐盐性与Ο?2和H2O2清除系统的关系,进一步完善盐生植物的耐盐与抗氧化之间的关系机理,在此基础上我们克隆了互花米草APX1、APX11、CAT1基因,并分析了其在高盐、重金属、ABA、干旱、低温及高温胁迫引起的氧化胁迫中的作用,结果如下: (1)胁迫处理对互花米草叶片MDA(丙二醛)含量和质膜透性的影响 分别用600mmol/LNaCl和500μmol/LCd2+处理互花米草幼苗,叶片中MDA含量和质膜透性分别较对照组有升高,说明高盐和重金属Cd2+对互花米草幼苗的胁迫已经造成膜系统的损伤,且重金属Cd2+对互花米草膜系统的损伤大于高盐对互花米草膜系统的损伤。 (2)胁迫处理对互花米草叶片脯氨酸含量和可溶性糖含量的影响 分别用600mmol/LNaCl和500μmol/LCd2+处理互花米草幼苗,叶片中脯氨酸含量较对照组有极显著升高(P<0.01),而可溶性糖的含量变化情况分别为极显著持续上升(P<0.01)和先剧烈升高后缓慢下降。这意味着脯氨酸和可溶性糖可能是调节互花米草受到高盐胁迫引起的渗透胁迫的主要渗透调节剂,而脯氨酸是Cd2+胁迫引起的渗透胁迫的主要渗透调节剂。 (3)胁迫处理对互花米草叶片Ο?2含量和H2O2含量的影响 在600mmol/LNaCl和500μmol/LCd2+处理下,互花米草体内Ο?2含量有极显著升高(P<0.01),H2O2含量有显著升高(P<0.05)。这说明互花米草在受到高盐和重金属胁迫引起的氧化胁迫时,产生大量ROS。 (4)胁迫处理对互花米草叶片抗氧化酶类活性的影响 互花米草叶片中的SOD、CAT、APX是清除Ο?2和H2O2的最基本的酶类,盐处理后其活性都有不同程度的改变。还原Ο?2为H2O2的SOD活性显著高于对照组,且随处理时间的延长呈先上升后下降趋势;清除H2O2的酶CAT、APX的活性则极显著高于对照(P<0.01),盐处理酶的变化趋势也为先上升后下降,而Cd处理酶的变化趋势为持续显著上升。同时非变性的聚丙烯凝胶电泳结果显示,虽然同工酶的不同亚型会随处理时间略有变化,但是总体活性的变化和测得的酶活性变化趋势吻合。这些结果意味着互花米草有着很强的抵抗盐胁迫和重金属胁迫引起的氧化胁迫的能力。 (5)互花米草SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1基因克隆及序列分析 利用简并PCR和5’、3’RACE克隆得到了互花米草抗氧化基因APX和CAT,分别命名为SaAPX1,SaAPX11和SaCAT1,均为胞质型蛋白。SaAPX1,SaAPX11序列非常相似,只在C末端有少量核苷酸的差别。 (6)互花米草SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1基因的表达谱分析 分别用20％PEG,100μmol/LABA,低温,高温处理互花米草幼苗,分别对其叶片和根进行目的基因表达谱分析,结果显示,在逆境处理下SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1全部表现为升高,升高的形式略有不同。 (7)互花米草SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1基因功能研究 过表达SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1的水稻及拟南芥纯合株系的筛选正在进行,生理生化指标有待测定。