【摘 要】
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以纯化的人颅骨成骨细胞为阳性靶细胞,从噬菌体展示十二肽库中筛选出能够与之特异性结合的多肽,为钛种植体表面的生物化修饰提供新的策略和研究方向。 第一部分:噬菌体展
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以纯化的人颅骨成骨细胞为阳性靶细胞,从噬菌体展示十二肽库中筛选出能够与之特异性结合的多肽,为钛种植体表面的生物化修饰提供新的策略和研究方向。 第一部分:噬菌体展示十二肽库筛选人成骨细胞特异性多肽的实验研究 以人颅骨成骨细胞作为靶细胞,对噬菌体展示十二肽库进行全细胞筛选,洗涤后将获得的细胞洗脱液和细胞裂解液分别培养计数,经四轮筛选后,从计数平板中随机挑选46个(洗脱、裂解各23个)分离良好的噬菌体克隆,以人牙龈成纤维细胞为对照细胞进行细胞ELISA检测、细胞免疫荧光等鉴定阳性噬菌体克隆并测序分析。 结果显示:共得到22个与成骨细胞特异性结合力高于成纤维细胞2倍以上的阳性克隆,氨基酸序列具有同源性。洗脱、裂解液中获得了共同的特异性结合多肽,比例相当,占有相近的结合优势,这也说明与成骨细胞具有高度亲和力的噬菌体是通过其表面展示的短肽与细胞特异性结合,而能够内化入细胞胞浆内的噬菌体也是通过这种受体介导的胞吞作用进行的。出现频率最高的多肽氨基酸序列为:MGWSWWPETWPM,对该多肽序列的氨基酸组成特点及其基本的生化特性进行分析。 第二部分:噬菌体展示十二肽库全细胞差减筛选人成骨细胞特异性多肽的实验研究 以人颅骨成骨细胞作为阳性靶细胞,人牙龈成纤维细胞为阴性吸附细胞,对噬菌体展示十二肽库进行全细胞差减筛选,洗涤后将获得细胞洗脱液培养计数,经四轮筛选后,从计数平板中随机挑选30个噬菌体克隆,分别用人颅骨成骨细胞和人牙龈成纤维细胞进行细胞ELISA检测、细胞免疫荧光等鉴定阳性噬菌体克隆并测序分析。其中共得到18个与成骨细胞特异性结合力高于成纤维细胞2倍以上的阳性克隆,其中比值最高者为4.88,取该纯化噬菌体样品(氨基酸序列为VLAVPWSEPGYL)进行细胞免疫荧光实验。 结果显示:表达该多肽(氨基酸序列为VLAVPWSEPGYL)的噬菌体克隆可大量聚集结合在人成骨细胞表面,在细胞内部呈现点簇状聚集而发出绿色荧光,成纤维细胞绿色荧光暗淡。对该多肽序列的氨基酸组成特点及其基本的生化特性进行分析。 总结:利用噬菌体肽库对人成骨细胞进行全细胞筛选,可获得与成骨细胞特异性结合的多肽序列,固相合成该多肽可为构建人成骨细胞特异性识别牙种植体表面提供前期研究基础。
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