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灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是一类世界性分布的死体营养型植物病原真菌，可侵染1,000多种植物，引起灰霉病(grey mould disease)，每年给农业生产造成严重的经济损失。由于其巨大的经济影响和科学价值，灰葡萄孢目前也已经成为研究死体营养型病原真菌的重要模式真菌。菌核是灰葡萄孢度过不良环境和繁殖的菌丝体结构，也是灰霉病的重要初侵染来源，抑制菌核的形成将切断灰霉病的病害循环。因此，研究灰葡萄孢菌核形成相关基因的功能和揭示菌核形成的分子机理将为灰霉病的有效防治提供新的理论依据。
为了筛选出灰葡萄孢菌核形成相关的基因，利用转录组测序技术比较分析了灰葡萄孢菌丝生长阶段和菌核形成阶段的差异表达基因，结果发现与菌丝生长阶段相比，两次生物学重复分别有1318和1249个基因在菌核形成阶段显著上调表达，有853和943个基因显著下调表达，推测其中有些基因可能在菌核发育过程中发挥重要功能。以RNA-Seq测序数据为基础，根据基因表达水平筛选出了10个在菌核形成阶段明显上调表达的基因和1个明显下调表达的基因进行深入研究。首先利用RT-PCR检测了菌核形成过程中目标基因的表达水平，结果显示与测序结果一致。同时发现BC1G_04708、BC1G_00896、BC1G_08642和BC1G_04810等基因在致病后期表达水平升高，BC1G_14271、BC1G_08490和BC1G_10623等基因在致病阶段未检测到表达。
为了进一步研究菌核形成相关基因的功能，利用基因敲除技术获得了上述基因的敲除转化子，并对各基因敲除转化子的生物学特性进行了测定。结果发现只有一个编码假定蛋白的基因BC1G_08490敲除后表型发生显著变化，敲除转化子?BC1G_08490-2在PDA平板上的菌落表面平滑，不能形成分生孢子和菌核，虽然该基因在致病阶段并不表达，但敲除转化子丧失了在拟南芥叶片上的致病力，可能是因为其产酸能力受到了明显影响，结果表明BC1G_08490基因在灰葡萄孢的菌核发育和致病过程中发挥重要作用。而其它基因BC1G_14271、BC1G_07408、BC1G_08642、BC1G_00896、BC1G_12892、BC1G_13021、BC1G_00448、BC1G_08931和BC1G_10623的敲除对灰葡萄孢的菌落形态、生长速度、菌核形成、致病力和产酸能力等均没有显著影响。我们推测，虽然这些基因在菌核形成过程和致病后期阶段显著上调表达，但它们在灰葡萄孢菌核形成及致病过程中并不起决定作用，或者存在功能冗余的基因。
在灰葡萄孢的基因组中鉴定了两个编码枯草杆菌蛋白酶的基因Bcser1和Bcser2，它们都包含一个inhibitorI9结构域和一个peptidaseS8结构域。Bcser1和Bcser2在菌核形成阶段以及菌丝侵染拟南芥叶片后期的表达量均有所升高，但Bcser1的上调倍数明显高于Bcser2。基因敲除结果表明Bcser1缺失对灰葡萄孢生长和致病均无明显影响。但Bcser2敲除严重影响了灰葡萄孢的菌核形成和孢子形成，菌丝生长速度也有所降低。此外，?Bcser2和?Bcser1/2在载玻片和洋葱表皮上均不能形成完整的侵染垫，丧失了侵染拟南芥和番茄叶片的能力，但是可以侵染受伤的叶片。结果表明Bcser2在灰葡萄孢的菌核发育和致病过程中发挥重要作用。
综上所述，本研究利用转录组测序技术分析筛选出了一批菌核形成相关的候选基因，并对部分基因进行了敲除，初步研究了各基因敲除转化子的生物学表型。明确了灰葡萄孢中的两个编码枯草杆菌蛋白酶基因Bcser1和Bcser2的功能，发现Bcser2对灰葡萄孢的菌核发育和致病过程均至关重要。本研究为深入解析灰葡萄孢菌核形成的分子机制提供了新的理论依据，也可为灰霉病的防治提供新的线索。
为了筛选出灰葡萄孢菌核形成相关的基因，利用转录组测序技术比较分析了灰葡萄孢菌丝生长阶段和菌核形成阶段的差异表达基因，结果发现与菌丝生长阶段相比，两次生物学重复分别有1318和1249个基因在菌核形成阶段显著上调表达，有853和943个基因显著下调表达，推测其中有些基因可能在菌核发育过程中发挥重要功能。以RNA-Seq测序数据为基础，根据基因表达水平筛选出了10个在菌核形成阶段明显上调表达的基因和1个明显下调表达的基因进行深入研究。首先利用RT-PCR检测了菌核形成过程中目标基因的表达水平，结果显示与测序结果一致。同时发现BC1G_04708、BC1G_00896、BC1G_08642和BC1G_04810等基因在致病后期表达水平升高，BC1G_14271、BC1G_08490和BC1G_10623等基因在致病阶段未检测到表达。
为了进一步研究菌核形成相关基因的功能，利用基因敲除技术获得了上述基因的敲除转化子，并对各基因敲除转化子的生物学特性进行了测定。结果发现只有一个编码假定蛋白的基因BC1G_08490敲除后表型发生显著变化，敲除转化子?BC1G_08490-2在PDA平板上的菌落表面平滑，不能形成分生孢子和菌核，虽然该基因在致病阶段并不表达，但敲除转化子丧失了在拟南芥叶片上的致病力，可能是因为其产酸能力受到了明显影响，结果表明BC1G_08490基因在灰葡萄孢的菌核发育和致病过程中发挥重要作用。而其它基因BC1G_14271、BC1G_07408、BC1G_08642、BC1G_00896、BC1G_12892、BC1G_13021、BC1G_00448、BC1G_08931和BC1G_10623的敲除对灰葡萄孢的菌落形态、生长速度、菌核形成、致病力和产酸能力等均没有显著影响。我们推测，虽然这些基因在菌核形成过程和致病后期阶段显著上调表达，但它们在灰葡萄孢菌核形成及致病过程中并不起决定作用，或者存在功能冗余的基因。
在灰葡萄孢的基因组中鉴定了两个编码枯草杆菌蛋白酶的基因Bcser1和Bcser2，它们都包含一个inhibitorI9结构域和一个peptidaseS8结构域。Bcser1和Bcser2在菌核形成阶段以及菌丝侵染拟南芥叶片后期的表达量均有所升高，但Bcser1的上调倍数明显高于Bcser2。基因敲除结果表明Bcser1缺失对灰葡萄孢生长和致病均无明显影响。但Bcser2敲除严重影响了灰葡萄孢的菌核形成和孢子形成，菌丝生长速度也有所降低。此外，?Bcser2和?Bcser1/2在载玻片和洋葱表皮上均不能形成完整的侵染垫，丧失了侵染拟南芥和番茄叶片的能力，但是可以侵染受伤的叶片。结果表明Bcser2在灰葡萄孢的菌核发育和致病过程中发挥重要作用。
综上所述，本研究利用转录组测序技术分析筛选出了一批菌核形成相关的候选基因，并对部分基因进行了敲除，初步研究了各基因敲除转化子的生物学表型。明确了灰葡萄孢中的两个编码枯草杆菌蛋白酶基因Bcser1和Bcser2的功能，发现Bcser2对灰葡萄孢的菌核发育和致病过程均至关重要。本研究为深入解析灰葡萄孢菌核形成的分子机制提供了新的理论依据，也可为灰霉病的防治提供新的线索。