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[背景]慢性肾脏疾病是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍,肾间质纤维化为慢性肾脏疾病的主要病理改变之一。病理结果是纤维化诊疗研究中最为直接的诊断证据,但是作为有创检查,在临床应用受到限制。血清学指标Ⅲ型胶原蛋白、GFR、白蛋白肌酐比等,影像学超声弹性成像、剪切波弹性成像等方法因可重复、无创受到研究者关注。纤维化过程复杂,涉及细胞和分子众多,目前的指标虽然通过不同角度直接或间接反应患者纤维化水平,但是特异性存在不足,研究认为肌成纤维细胞非可逆活化作为纤维化中至关重要一个节点,但是缺乏相应的检测指标。特异性标记物筛选仍旧是纤维化研究和诊疗过程最为主要的挑战。CD248(内皮唾液酸蛋白),属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。近期研究证实在病理性纤维化疾病中CD248的表达明显上调。并且其表达程度与组织的纤维化程度成正相关关系。研究认为其与肌成纤维细胞活化密切相关,我们的研究也确定干扰CD248分子可以影响纤维化进程。CD248分子能否作为慢性肾脏疾病纤维化进程新型诊断标志物受到关注。[研究目的]本研究以尿蛋白阳性患者尿液样本为研究对象,通过检测尿液中CD248蛋白,结合患者其它肾损伤相关指标以及疾病特征进行分析,从而探讨CD248蛋白能否作为慢性肾脏病新型尿液标志物。[方法]1.CD248特异性单克隆抗体制备:采用原核表达CD248重组蛋白免疫小鼠,取免疫成功小鼠脾脏,PEG细胞融合法进行融合获得杂交瘤细胞,间接ELISA筛选CD248阳性杂交瘤细胞株;杂交瘤细胞小鼠腹腔注射后,辛酸-硫酸铵法纯化腹水中抗体,SDS-PAGE鉴定抗体纯化效果;免疫印迹分析抗体与CD248重组蛋白、SJSA-1细胞CD248蛋白反应情况、流式细胞仪检测抗体与SJSA-1细胞膜蛋白CD248反应情况;ELISA检测抗体亲和力情况。2.临床标本验证:随机挑选5例蛋白尿样本,免疫印迹检测尿液CD248蛋白。收集137例尿液标本(健康人尿:10例;Non-CKD蛋白尿:22例;CKD蛋白尿:105例)。其中糖尿病肾病34例;肾移植状态13例;IgA肾病9例;慢性肾小球肾炎49例。收集样本采集当日的血肌酐、胱抑素C以及疾病病程相关数据,免疫印迹法检测慢性肾脏疾病患者尿液样本CD248,非参数检验(行×列表资料的χ2检验)分析与CKD分期、CRF血肌酐分期、胱抑素C含量、疾病病程之间的相关性。[结果]1.筛选出6株CD248特异性单克隆抗体(M3F、M3H、M4A、M4B、M4C、M5)。免疫印迹结果显示6株抗体均能与MBP-CD248重组蛋白以及SJSA-1表达的CD248蛋白结合;流式细胞检测中有3株抗体能够与SJSA-1表达的CD248蛋白结合分别为:M3F、M4C、M5;6株抗体的亲和力分别为(单位:mM):M3F:0.07、、M3H:0.07、、M4A:0.08、、M4B:0.10、M4C:0.05、M5:0.32。2.①免疫印迹分析得出CD248在蛋白尿中存在表达;②在Non-CKD中CD248的阳性率为:13.6%,在CKD尿液中CD248阳性率为:53.3%;P<0.05③CKD1-5期尿液中CD248的阳性率分别:33.3%、53.3%、55.5%、51.7%、61.3%;P<0.05④在CRF肌酐分期中,5组的CD248的阳性率分别为:36.6%、61.5%、50%、62.5%、66.7%;P<0.05⑤胱抑素C正常参考值组CD248阳性率:33.3%,大于参考值上线组阳性率:61.2%;P<0.05⑥糖尿病肾病病程1-5年、5.1-10年、10.1年以上各组CD248的阳性率分别为:50%、52%、66.7%;P<0.05;各组CKD的分布情况P>0.05;⑦将肾移植分为移植5年内与移植5年以上,CD248阳性率分别为:14%、50%;两组CKD的分布情况P>0.05。[结论]1.6株抗体均能与CD248蛋白变性表位结合;3株抗体能够结合CD248空间构象位点;6株抗体的亲和力检测中M5亲和力最高。2.CD248可具有作为慢性肾脏疾病早期检测标志物的潜能,以及在反应疾病病情进展上尿液中CD248的表达情况可能较CKD更具有临床价值。