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中期因子(Midkme,MK)是一种肝素结合生长因子,MK基因主要在胚胎期表达,随着发育的进展表达组织逐渐局限,表达量逐渐减少,在成年个体的肺、结肠、胃、肾和脾等器官中表达量极低。但近年来研究发现,MK在多种肿瘤组织中的表达比相应的癌旁和正常组织显著增高,且在恶性肿瘤组织中还发现有MK的缺失突变体(tMK)表达,尤其在恶性转移性淋巴结中tMK高频率表达,而不出现在正常组织中。由此推测MK表达及变异与肿瘤的发生、发展和转移有关,研究MK在肿瘤患者的肿瘤组织中的表达特性及其作用机制将可能为肿瘤的诊断和治疗提供新途径。
为了研究MK在中国胃肿瘤患者的肿瘤组织中的表达情况及MK在胃肿瘤中的作用机制,本文开展了以下实验:
根据Genbank报道的序列,设计引物,通过RT-PCR从胃肿瘤患者肿瘤组织中获得了Midkine(MK)成熟肽DNA编码序列,与pMD18T-vector连接测序后,将该片段克隆入大肠杆菌表达载体pET30a(+)中,转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选得到可诱导表达MK重组蛋白的工程菌株pEMK,经IPTG诱导表达产生的总蛋白用Heparin结合的亲和柱纯化,MTT法验证表明大肠杆菌表达产生的MK蛋白具有促进NIH3T3肿瘤细胞增殖的活性。并且利用纯化的MK重组蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备了识别天然蛋白的多克隆抗体。
利用制备的MK多克隆抗体研究胃癌组织中MK的表达水平及其定位,探讨MK与肿瘤的关系。通过RT-PCR、real—time PCR和免疫组化的方法,检测9例正常胃镜组织、37例胃肿瘤组织及其相应的配对癌旁组织中MK的表达情况,对Midkine的表达进行定性、定量和定位分析,并进一步分析了MK表达水平与肿瘤临床病理之间的关系。RT—PCR定性分析表明,MK在胃癌组织中高表达(表达率为94.6％),癌与癌旁MK表达有显著差异,而且癌与正常组织有显著差异。Real—time PCR定量分析结果证实了定性分析的结果,而且发现MK的表达与肿瘤的临床分期及远处转移情况相关,而与肿瘤的组织分化、大小及淋巴结转移情况无关。免疫组化定位分析发现,MK蛋白广泛存在于瘤细胞的细胞质,此外,细胞核和核仁也有MK聚集,细胞外组织中腺泡处MK表达尤为明显。
为检测MK和tMK在胃肿瘤发生发展中的作用,构建MK和tMK真核表达质粒,转染胃肿瘤细胞BGC823。利用CCK-8 Kit检测细胞的增殖、用软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,将转染细胞接种裸鼠皮下分析MK和 tMK促肿瘤形成能力。结果表明,与对照组相比,MK和tMK能够明显的促进BGC823细胞增殖和克隆形成,并且tMK的作用比MK的强。在裸鼠体内,MK和tMK能缩短肿瘤形成时间,并且肿瘤生长快、体积大、重量重,瘤内血管分布密集。
为了以MK为靶点进行肿瘤治疗的研究,采用脂质体介导的MK-siRNA转染胃肿瘤细胞BGC823和SGC7901,检测细胞的增殖能力、克隆形成能力以及细胞凋亡情况。CCK-8和平板克隆形成实验结果表明,MK-siRNA明显抑制细胞增殖和克隆形成。流式细胞仪分析结果显示,MK-siRNA转染后早期凋亡细胞及坏死细胞数明显增多。进一步分析表明细胞凋亡与线粒体膜电位倒塌、细胞色素C的释放、caspase3、8和9的活化有关。
为探讨MK信号转导系统在肿瘤发生发展中作用,利用基因芯片技术分析与MK表达相关的基因。结果MK高表达后,从22000条基因中筛选出差异表达基因550个,上调基因有407个,下调基因143个,变化基因多分布在氨基酸代谢、核苷酸代谢、脂肪代谢、糖酵解、激素代谢及与细胞增殖、粘附、迁移相关的信号通路中。本研究为对MK家族信号转导系统深入研究、针对其调节网络设计新药物及恶性肿瘤的基因治疗提供了基础。