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目的:通过构建pc DNA3.1(+)-FSHα质粒,进行FSHα及β亚基共转染,从转录、翻译及蛋白质水平,判断该突变位点是否会影响FSH的转录、翻译、空间结构和生物学功能,为进一步研究FSH的生理功能,提供天然模型。方法:1、设计引物:根据在NCBI中查到人FSHα亚基的核酸序列设计引物2、基因扩增:以人体子宫肌瘤组织中提取的RNA为模版,根据上文设计的引物,进行基因扩增,以获取FSHα基因片段。3、载体构建:构建pc DNA3.1(+)-FSHα载体(质粒3)。β亚基突变型质粒载体pc DNA3.1(+)-FSHβ(MU)(质粒1)及野生型质粒pc DNA3.1(+)-FSHβ(WT)(质粒2)均已制备。4、细胞培养及共转染:分成三个组,MU组突变组:拟转染质粒1+质粒3,WT组野生组:拟转染质粒2+质粒3,CK组空白组:拟转染空白pc DNA3.1(质粒4)。将拟转染质粒瞬时共转染进中国仓鼠卵巢细胞内。5.转染细胞裂解液的处理:48小时后,提取细胞裂解液行PCR及western-blot检测。6.转染上清液的处理:(1)取上清液,增加空白对照组(完全培养基,为MEDIA组)检测FSH的免疫活性。(2)取上清液,分别处理人卵巢颗粒肿瘤细胞,增加空白对照组(添加完全培养基,为MEDIA组)。(3)处理6小时后,测定细胞裂解液中c AMP的浓度。结果:1、WT组、MU组分别检测到了FSHα、野生型FSHβ和突变型FSHβ的m RNA;CK组未检测到FSHα和β的m RNA。2、WT组和MU组细胞裂解液检测到了FSH的表达,CK组未检测到蛋白表达。3、WT组检测到上清液高水平的FSH,显著高于其余三组。4、WT组细胞裂解液c AMP浓度显著性高于其余三组,其余三组之间无显著性差异。结论:1、pc DNA3.1(+)-FSHα载体构建成功。FSHα、野生型FSHβ和突变型FSHβ基因均可在细胞内成功转录和翻译。2、上清液中可以检测到野生型FSH的免疫活性,结合前期实验,确定在体外时只有当α及β亚基结合后,FSH才能被能分泌出胞外,发挥免疫及生物学功能。3、p.Arg97X突变在体外不影响FSHβ亚基的转录和翻译,但是在细胞外检测不到突变FSH的免疫活性和生物活性,说明该突变位点影响了FSH形成正确的二聚体结构,进而影响了FSH免疫及生物学功能的发挥。