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脑卒中是威胁人类健康的第二大致死性疾病,具有高患病率、高复发率、高致残率、高死亡率的特点,而缺血性卒中占了脑卒中的60％～70％,目前的临床治疗效果还不尽人意。近年来,研究者们逐渐将研究重点转移到脑自身的内源性保护机制,即缺血/低氧预适应(Ischemic/Hypoxicpreconditioning,I/HPC)。
我们课题组在以往的研究中利用小鼠整体HPC模型、海马脑片氧.糖剥夺(OGD)模型和离体细胞低氧模型发现,经典型PKCγ(cPKCγ)的激活可能参与了小鼠脑I/HPC的发生发展过程。然而,cPKCγ及其相互作用蛋白在I/HPC减轻小鼠缺血性脑损伤中的作用还不得而知。因此,本实验采用KEGG富集分析及功能性蛋白质组学分离鉴定了小鼠大脑皮层组织中cPKCγ相互作用蛋白,并分析重要的差异信号蛋白在缺血/低氧发生中的作用,以进一步明确cPKCγ的作用机制。
本实验分为在体实验和离体实验两部分。在体实验,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g)按以往报道方法制备整体HPC模型。利用免疫共沉淀、双向电泳和质谱等蛋白质组学技术分离并鉴定小鼠脑组织中cPKCγ/相互作用蛋白。离体实验中,利用蛋白印迹技术定量分析了NMDA对cPKCγ相互作用蛋白CRMP2表达、磷酸化水平的影响;利用MTT技术评估NMDA对过表达CRMP2蛋白的N2A细胞的损伤作用;通过MTT及Hoechst33342-PI染色评价TAT-CRMP2对N2A细胞的保护作用。实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和Bonferroni显著性检验进行统计学处理,并用均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p＜0.05为显著性差异。实验结果如下:
1.低氧预适应小鼠脑皮层组织cPKCγ相互作用差异蛋白鉴定
为揭示参与HPC脑保护作用的cPKCγ信号网络,我们应用蛋白质组学和免疫共沉淀技术对正常及HPC小鼠大脑皮层胞浆和膜相关蛋白组分中cPKCγ相互作用蛋白进行了分离和鉴定,正常小鼠脑皮层组织内,共鉴定到41个cPKCγ相互作用蛋白,其中胞浆成分18个,膜相关成分37个,两部分共有cPKCγ相互作用蛋白14个。利用凝胶分析软件对HPC前后的cPKCγ相互作用蛋白双向电泳图谱进行分析,胞浆成分中8个蛋白点在HPC后发生了明显变化(变化超过1.5倍),其中3个上调,5个下调;膜相关成分中15个蛋白在HPC后变化明显,其中14个显著上调,1个下调。根据鉴定结果,在胞浆成分中,HPC后CRMP2与cPKC7相互作用表达量增加,提示HPC使二者相互作用增强,cPKCγ-CRMP2可能参与了HPC的形成。
2.NMDA对原代培养海马神经元CRMP2蛋白表达及磷酸化水平影响
海马神经元培养10-14d,采用终浓度分别为100、200、300、400和500μM的NMDA(同时加入1/10浓度的甘氨酸)作用6h。利用蛋白印迹(Westernblot)及凝胶成像定量分析CRMP2蛋白表达、磷酸化水平及其水解程度。结果发现,CRMP2蛋白表达量分别为100％、98.9％±14.7％、91.9％±9.45％、100.6％±6.13％、113.8％±7.76％、104.6％±24.7％(n=5),NMDA作用后未见显著变化:与对照组相LL(100％),NMDA处理组CRMP2磷酸化水平显著降低(n=5),分别为51.6％±7.61％、47.4±14.1％、34.9％+14.6％、54.5±17.9％、53.5±17.7％:NMDA处理后,55KD水解产物(BDP)蛋白量相开始出现,但其相对量未随NMDA作用浓度增加而变化,各实验组BDP相对量分别为0、100％、135.80％±20.37％、134.56％±12.48％、129.31％±4.53％、101.48％±20.93％。在本实验条件下,NMDA对CRMP2去磷酸化及蛋白水解为非浓度依赖性。
我们继续观察NMDA作用不同持续时间对CRMP2蛋白表达、磷酸化水平及水解片段形成的影响。海马神经元培养10-14d,加入NMDA(300μM)/甘氨酸(30μM),我们设定以下时问点进行分析探讨,分别为10min或2、4、6、24h。利用Westernblot及凝胶成像定量分析CRMP2蛋白表达、磷酸化水平及其水解水平进行分析。结果发现,CRMP2蛋白表达量分别为:100％、80.8％±8.39％、111.8％+24.3％、94.4％±16.8％、88％±15.3％、58.2％±4.43％,NMDA作用后蛋白表达量未见显著变化。6h后,CRMP2磷酸化水平显著降低(n=5),CRMP2磷酸化水平分别为:100％、79.9％±7.68％、75.9％±6.45％、73.3％±11.4％、64％±8.93％、56.4％±14.2％。2h后,55KD处开始出现水解片段,各实验组蛋白水解量分别为:0、0、100％、95.01％±7.46％、110.30％±16.54％、35.52％±10.50％)。在本实验条件下,NMDA对CRMP2去磷酸化及水解随持续时间延长未见增加。结果提示CRMP2去磷酸化及蛋白水解参与了NMDA的损伤。
3、过表达CRMP2蛋白对NMDA毒性刺激的影响
在前面的研究中,我们发现CRMP2参与了NMDA的损伤过程,然而其参与机制是促进或是拮抗NMDA毒性作用还未得到验证。我们采用CRMP2重组质粒(pDsRED2-N1-Dpys12-RFP)转染N2A细胞,转染72h后,在无血清培养基中加入300gMNMDA作用6h进行MTT实验。实验分为对照组、NMDA组、转染空质粒+NMDA组(空质粒组)及转染重组质粒+NMDA组(重组质粒组),细胞存活率分别为:100％、56.4％±1.23％、54.6％±0.6％、37.2％±1.49％。NMDA组、空质粒组、重组质粒组的细胞存活率均明显降低;重组质粒组细胞存活率低于NMDA组及空质粒组。CRMP2过表达可加重NMDA的毒性作用,提示CRMP2可能作为损伤蛋白参与NMDA的作用。
4、TAT-CRMP2对NMDA损伤作用的影响
我们设计了肽段TAT-CRMP2,可通过减少Calpain对内源性CRMP2的水解,减少BDP的形成。本实验分为对照组、NMDA处理组(NMDA组、)、生理盐水+NMDA组(生理盐水组)、低浓度TAT-CRMP2预处理+NMDA组(低浓度组)、高浓度TAT-CRMP2预处理+NMDA组(高浓度组)。MTT实验后,各组细胞存活率分别为100％、57.3％±5.22％、59.0％±7.85％、83.5％±4.86％、87.1％±3.6％。NMDA组、生理盐水组的细胞存活率显著低于对照组(n=6),而高浓度组及低浓度组的细胞存活率均明显高于NMDA组和生理盐水组(n=6)。结果显示,CRMP2水解片段的减少可以降低NMDA导致的细胞死亡。
我们采用HOECHST33342-PI双染色法,进一步观察了TAT-CRMP2预处理对NMDA损伤的保护作用,实验分为对照组、生理盐水+NMDA组(生理盐水组)、低浓度TAT-CRMP2+NMDA组(低浓度组)及高浓度TAT-CRMP2+NMDA组(高浓度组),各组细胞死亡率分别为:1、24.56±5.57、18.92±2.44、7.083±1.75。生理盐水组、低浓度组的细胞死亡率显著高于对照组(n=3),高浓度组的细胞死亡率显著低于生理盐水组、低浓度组,对照组与高浓度组之间未见显著性差异。适当浓度的TAT-CRMP2可以显著降低NMDA损伤,提示蛋白水解可能是CRMP2参与细胞损伤的主要途径。
综上所述,cPKCγ与胞浆蛋白CRMP2存在相互作用,此作用在HPC后加强,一定浓度NMDA作用6h后均可降低CRMP2的磷酸化水平,并且可在55KD处出现水解片段,NMDA作用早期未见水解片段形成;过表达CRMP2可促进NMDA对神经细胞的致死作用;采用TAT-CRMP2预处理细胞,可以明显降低NMDA的细胞毒性作用。本研究成果进一步丰富了人们对脑缺血/低氧损伤和适应相关信号转导机制的认识,并为临床寻找防治脑卒中等缺血/低氧性脑损伤药物提供了实验依据。